【摘要】：目的:本文旨在討論高遷移率族蛋白B1(High mobility group box protein 1,HMGB1)介導(dǎo)的自噬-溶酶體通路對高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(Acute retinal pegment epitheliitis-19,ARPE-19)炎癥和凋亡的作用及其機(jī)制。方法:將ARPE-19細(xì)胞分為正常組和高糖組,在培養(yǎng)液中加入自噬抑制劑3-MA或轉(zhuǎn)染HMGB1的siRNA,并設(shè)立相應(yīng)的對照組。采用電子顯微鏡檢查自噬體;利用免疫熒光技術(shù)檢測自噬相關(guān)蛋白的表達(dá);Western blotting檢測自噬相關(guān)蛋白及HMGB1的表達(dá);流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡;DCFH-DA法檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量;通過JC-1檢測線粒體膜電位;ELISA檢測細(xì)胞炎癥因子及VEGF的表達(dá)。結(jié)果:與正常組比較,高糖條件下細(xì)胞內(nèi)的自噬體數(shù)量明顯增加,自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)明顯增加,自噬產(chǎn)生的降解底物積累明顯增加,溶酶體膜通透性增加,溶酶體酶活性下降,HMGB1表達(dá)增加。與高糖對照組相比,在高糖組加入自噬抑制劑3-MA后,細(xì)胞凋亡明顯進(jìn)一步增加,炎癥因子IL-1β、IL-6和IL-8以及VEGF的釋放進(jìn)一步增多。利用siRNA干擾HMGB1的表達(dá)后,與高糖組相比,轉(zhuǎn)染HMGB1siRNA的細(xì)胞HMGB1蛋白表達(dá)水平降低,自噬產(chǎn)生的降解底物和溶酶體膜通透性降低,溶酶體酶活性增加,線粒體膜電位升高,細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生以及細(xì)胞色素C的釋放明顯減少,細(xì)胞凋亡明顯受到抑制,炎癥因子IL-1β、IL-6和IL-8以及VEGF的表達(dá)明顯降低。結(jié)論:1、高糖可以激活自噬,但由于溶酶體通透性增加,溶酶體功能受損,導(dǎo)致自噬-溶酶體降解功能受損。2、高糖環(huán)境下,抑制細(xì)胞自噬活性會促進(jìn)細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致炎癥因子IL-1β、IL-6和IL-8以及VEGF釋放進(jìn)一步增加。3、高糖可誘導(dǎo)細(xì)胞HMGB1表達(dá)增加,在抑制HMGB1表達(dá)以后,其可能通過降低溶酶體膜通透性,從而恢復(fù)細(xì)胞自噬降解功能,使線粒體膜電位升高,減少ROS的產(chǎn)生,并減少細(xì)胞色素C的釋放,從而抑制細(xì)胞凋亡,并減少炎癥因子及VEGF釋放。
【圖文】：

圖 1 高糖處理后各組 ARPE-19 細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白及自噬體（紅色圈表示自噬溶酶體，黑色圈表示自噬小泡）的表達(dá)Figure 1 Analysis of protein expressions of Beclin 1,ATG5 and LC3 and autophagosome (redcircles mean autophagolysosome and black circles meanautophagic vacuole. ) in ARPE-19 cellsfrom different groups after HG treatment. Scale bars: 2 μm (left), 1 μm (right). (*: P<0.05; **:P<0.01; ***: P<0.001)2.2 高糖可抑制 ARPE-19 細(xì)胞自噬降解能力為了研究高糖條件下 ARPE-19 細(xì)胞自噬的降解能力，我們將細(xì)胞置于高葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，，利用 Western blotting 分別在 0 小時，12 小時，24 小時，48 小時檢測自噬選擇性底物 P62/SQSTM1（此后，簡稱 P62）的表達(dá)，結(jié)果如圖 2a 所示，隨著在高糖條件下培養(yǎng)時間的延長，P62 的積累逐漸增加（P <0.05），并在 24 小時達(dá)到最高峰（故此后我們把研究時間點放在 24 小時）。此外，為了進(jìn)一步驗證蛋白水平檢測的結(jié)果，我們利用免疫熒光的方法檢測了在低葡萄糖和高葡萄糖培

圖 2 高糖對自噬降解功能的影響Figure 2 Effects of HG on the degradative function of autophagy in ARPE-19 cells. Scale bars:25 μm (***: P<0.001)2.3 高糖環(huán)境可導(dǎo)致 ARPE-19 細(xì)胞溶酶體功能障礙，從而抑制其自噬降解能力為了研究高糖條件下 ARPE-19 細(xì)胞溶酶體功能狀況，我們分別在低葡萄糖和高葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng) 24 小時，然后對溶酶體酶 B（cathepsin B, CB）和溶酶體酶 L（cathepsin L, CL）活性進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示在高糖條件下培養(yǎng)的 ARPE-19 細(xì)胞內(nèi)的 CB（圖 3a）和 CL（圖 3b）活性較低糖組均明顯降低（P <0.05）。同時，為了檢測 LMP 是否增強(qiáng)，我們利用免疫熒光對 CB 和溶酶體特異性蛋白 LAMP1進(jìn)行共定位染色，結(jié)果如圖 3c 所示，較低糖組相比，高糖條件下培養(yǎng)的 ARPE-19細(xì)胞中，大量 CB 沒有共定位于溶酶體當(dāng)中，而是散布在細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中（P <0.05）。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R587.2;R774.1

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本文編號：2620047