【摘要】：目的:中耳膽脂瘤是一種良性的鱗狀上皮角質(zhì)化增生性的病變,由鱗狀層狀角質(zhì)化上皮細胞組成,它表現(xiàn)為一種含有成纖維細胞和炎性細胞的表皮樣囊腫。中耳膽脂瘤的特點是細胞過度增殖,伴隨的是角蛋白碎片的積累和顳骨及其周圍骨結(jié)構(gòu)的破壞。除導致聽力損傷和耳流膿外,膽脂瘤還可以導致多種顱內(nèi)外并發(fā)癥,如迷路炎、面癱、乙狀竇血栓性靜脈炎、腦膜炎、腦膿腫等。膽脂瘤發(fā)病機制復雜,影響因素很多,至今未明確其具體發(fā)病機制。RECK(反轉(zhuǎn)錄富含半胱氨酸蛋白)基因是Takahashi等在1998年將v-ki-ras轉(zhuǎn)染細胞株NIH3T3中發(fā)現(xiàn)的新型轉(zhuǎn)錄抑制基因。其表達在正常組織中普遍存在,但在許多腫瘤細胞系和由多種致癌基因轉(zhuǎn)化的成纖維細胞系中檢測不到,與許多腫瘤和炎性疾病的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關(guān),其抑制腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的作用是通過抑制多種基質(zhì)金屬蛋白酶的表達而實現(xiàn)。MMP-2,9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中很重要的兩種,它以無活性的前體形式產(chǎn)生,作用非常廣泛。既可降解明膠與膠原、彈性蛋白(elastin)、層粘連蛋白(laminin)A鏈,又能降解間質(zhì)膠原和基質(zhì)蛋白等。MMP基因的嚴格調(diào)控對組織的破壞和重建平衡至關(guān)重要。如果過表達,結(jié)締組織破壞會導致出現(xiàn)病理情況,像關(guān)節(jié)炎和牙周炎。目前在很多炎性疾病中RECK均為低表達,但RECK在中耳膽脂瘤的發(fā)生發(fā)展中表達及生物學功能尚不清楚,本課題對RECK在中耳膽脂瘤中的表達及在中耳膽脂瘤疾病進展過程中的作用機制進行了研究。研究方法:1、收集2017年2月~2017年10月在盛京醫(yī)院耳科病房手術(shù)的部分中耳膽脂瘤標本36例,同時收集術(shù)耳外耳道皮膚29例(開放式乳突切除術(shù)+鼓室成形術(shù)+耳甲腔成型術(shù)中廢棄不用的外耳道皮膚的小碎塊)作為對照組。應(yīng)用RT-PCR檢測中耳膽脂瘤和外耳道皮膚中RECK、MMP2、MMP9的mRNA的表達情況。應(yīng)用Western Blot蛋白印跡檢測中耳膽脂瘤和外耳道皮膚中MMP2、MMP9的蛋白表達情況。2、培養(yǎng)人永生化表皮細胞HaCaT(human immortalized keratinocyte),細胞的培養(yǎng)液為DMEM(含2ml-glutamine)+10%胎牛血清,培養(yǎng)條件為37℃,5%CO2,恒溫孵箱貼壁培養(yǎng),三天傳代一次,傳代時用0.25%胰酶恒溫孵箱消化3min,重懸細胞按1:2傳代。通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染構(gòu)建沉默RECK基因和過表達RECK基因的HaCaT細胞。應(yīng)用實時定量PCR檢測RECK mRNA表達水平以評估是否成功構(gòu)建沉默RECK基因和過表達RECK基因的HaCaT;通過MTS法檢測沉默和過表達RECK對HaCaT細胞增殖能力的影響。結(jié)果:1、RT-PCR結(jié)果顯示,中耳膽脂瘤中的RECK mRNA的相對表達量為0.723±0.099,低于外耳道皮膚1.181±0.121(P=0.004);中耳膽脂瘤中MMP2和MMP9的mRNA的相對表達量分別為11.180±3.158和99.350±31.920,顯著高于外耳道皮膚2.013±0.495(P=0.012)和1.522±0.529(P=0.007);Western Blot結(jié)果顯示,中耳膽脂瘤中的MMP2和MMP9的蛋白相對表達量分別為4.105±1.209和15.980±6.520,明顯高于外耳道正常皮膚0.666±0.215(P=0.040)和1.033±0.375(P=0.047)。2、si-RECK轉(zhuǎn)染組與con未轉(zhuǎn)染組RECK mRNA相對表達量分別為0.581±0.107和1.033±0.033(P=0.016),si-RECK轉(zhuǎn)染組HaCaT細胞中RECK mRNA表達明顯低于con未轉(zhuǎn)染組,成功沉默RECK基因。OE-RECK轉(zhuǎn)染組與con未轉(zhuǎn)染組RECKmRNA相對表達量分別為70.040±22.640和1.033±0.033(P=0.038),OE-RECK轉(zhuǎn)染組HaCaT細胞中RECK mRNA表達明顯高于con未轉(zhuǎn)染組,成功過表達RECK基因。通過MTS法檢測下調(diào)RECK基因后HaCaT細胞的增殖能力的變化,第24h HaCaT細胞的con組、si-RECK NC組、si-RECK組細胞增殖情況分別為1.179±0.044,1.191±0.028,1.442±0.034,si-RECK轉(zhuǎn)染組HaCaT細胞增殖能力明顯高于si-RECK NC組(P=0.005)和空白對照組(P=0.009);第48h HaCaT細胞的con組、si-RECK NC組、si-RECK組細胞增殖情況分別為1.540±0.088,1.548±0.109,2.071±0.116,si-RECK轉(zhuǎn)染組HaCaT細胞增殖能力明顯高于si-RECK NC組(P=0.030)和空白對照組(P=0.022);第72h HaCaT細胞的con組、si-RECK NC組、si-RECK組細胞增殖情況分別為1.869±0.129,1.895±0.136,3.242±0.119,si-RECK轉(zhuǎn)染組HaCaT細胞增殖能力明顯高于si-RECK NC組(P=0.001)和空白對照組(P=0.001),而si-RECK NC組與空白對照組HaCaT細胞增殖能力無明顯差異(P0.05)。通過MTS法檢測RECK基因過表達后HaCaT細胞的增殖能力的變化,第24h HaCaT細胞的con組、OE-RECK NC組、OE-RECK組細胞增殖情況分別為1.553±0.042,1.579±0.040,1.196±0.035,OE-RECK轉(zhuǎn)染組HaCaT細胞增殖能力明顯低于OE-RECK NC組(P=0.002)和空白對照組(P=0.002);第48h HaCaT細胞的con組、OE-RECK NC組、OE-RECK組細胞增殖情況分別為1.712±0.074,1.771±0.084,1.314±0.013,OE-RECK轉(zhuǎn)染組HaCaT細胞增殖能力明顯低于OE-RECK NC組(P=0.005)和空白對照組(P=0.006),而OE-RECK NC組與空白對照組HaCaT細胞增殖能力無明顯差異(P0.05)。結(jié)論:1、RECK在中耳膽脂瘤中的表達低于外耳道皮膚,MMP2和MMP9在中耳膽脂瘤中的表達高于外耳道皮膚。RECK,MMP2,MMP9的表達模式可能在中耳膽脂瘤疾病進展過程中起到一定的促進作用,還可能有助于為中耳膽脂瘤的臨床治療提供新的思路。2、干擾RECK基因可以調(diào)控HaCaT細胞的增殖能力,沉默RECK促進細胞增殖,過表達RECK抑制細胞增殖,提示依據(jù)RECK基因而設(shè)計的分子診斷和基因治療有可能應(yīng)用于中耳膽脂瘤的臨床治療。
【圖文】：

圖 1 中耳膽脂瘤及外耳道皮膚中 RECK mRNA 的表達情況表外耳道皮膚組織，C 代表中耳膽脂瘤組織，*表示與外耳道皮膚對比 P<0.0P2 在中耳膽脂瘤中的表達高于外耳道皮膚。2 在中耳膽脂瘤中的表達明顯高與外耳道皮膚，用 2-ΔΔCT 計算組的 MMP2 mRNA 相對表達量分別為 11.180±3.158 和 2.013±0學意義（P=0.012）。對樣本相對灰度值分析結(jié)果顯示，中耳膽脂白的相對表達量 4.105±1.209，高于外耳道皮膚 0.666±0.215（P=0

圖 2 MMP2 在中耳膽脂瘤與外耳道皮膚的表達情況A 圖上半部分為 MMP2 蛋白凝膠電泳圖，GAPDH 作為內(nèi)參，下半部分為 MMP2 蛋白相對表達水平。B 為 MMP2 在中耳膽脂瘤組織及外耳道皮膚中 mRNA 相對表達水平。N 代表外耳道皮膚，C 代表中耳膽脂瘤。*表示與外耳道皮膚對比 p<0.05。**表示與外耳道皮膚對比 P<0.01。3.3 MMP9 在中耳膽脂瘤的表達高于外耳道皮膚。中耳膽脂瘤和外耳道皮膚 MMP9 mRNA 相對表達量分別為 99.350±31.920 和1.522±0.529，，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.008），對樣本相對灰度值分析結(jié)果顯示，膽脂瘤中 MMP9 的相對表達量 15.980±6.520 顯著高于外耳道皮膚 1.033 ±0.375（P=0.047）差異具有統(tǒng)計學意義。如圖 3 所示
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R764.2

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本文編號：2606102