【摘要】：目的:觀察X線對鼻咽癌HONE-1細(xì)胞形態(tài)、增殖、侵襲及克隆形成等功能和轉(zhuǎn)錄激活因子5(Activating transcription factor 5,ATF5)等蛋白表達(dá)的影響,再比較復(fù)發(fā)鼻咽癌組織和初發(fā)鼻咽癌組織ATF5蛋白表達(dá)水平差異,初步探討ATF5參與鼻咽癌細(xì)胞放射抵抗的可能機(jī)制,為提高鼻咽癌放療敏感性提供理論依據(jù)。方法:采用X射線常規(guī)分割照射鼻咽癌HONE-1細(xì)胞建立放療抵抗細(xì)胞株HONE-1R;通過克隆形成實(shí)驗(yàn)、多靶單擊模型擬合生存曲線及增殖實(shí)驗(yàn)鑒定HONE-1R細(xì)胞;顯微鏡觀察并記錄鼻咽癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;采用免疫組織化學(xué)法檢測6例同一初發(fā)和復(fù)發(fā)鼻咽癌患者的原發(fā)灶組織及鼻咽正常組織中ATF5蛋白的表達(dá)水平;免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測X線對HONE-1細(xì)胞ATF5、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)蛋白表達(dá)水平的影響;細(xì)胞免疫熒光法檢測X線對HONE-1細(xì)胞ATF5蛋白的細(xì)胞定位及表達(dá)變化;再構(gòu)建、包裝shRNA-ATF5慢病毒載體,用qRT-PCR驗(yàn)證shRNA-ATF5的干擾效率;克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測X線及shRNA-ATF5對HONE-1細(xì)胞和HONE-1R細(xì)胞克隆形成能力;多靶單擊模型擬合生存曲線分析X線及shRNA-ATF5對兩種鼻咽癌細(xì)胞接受2Gy X線照射后存活分?jǐn)?shù)(Survival fraction at 2Gy,SF2)值的影響;CCK-8法增殖實(shí)驗(yàn)和Transwell小室實(shí)驗(yàn)分別檢測X線和shRNA-ATF5對兩種鼻咽癌細(xì)胞生存率、遷移力和侵襲力的影響情況。結(jié)果:(1)X線能促進(jìn)鼻咽癌HONE-1細(xì)胞ATF5蛋白水平顯著增加,且隨X線照射劑量的增加而增加(P均0.05),其亞細(xì)胞定位由細(xì)胞漿轉(zhuǎn)向于細(xì)胞核。(2)鼻咽癌HONE-1R細(xì)胞克隆形成率顯著大于鼻咽癌HONE-1細(xì)胞(P0.05),HONE-1R細(xì)胞SF2值是HONE-1細(xì)胞的1.712倍;經(jīng)0~10Gy X線常規(guī)分割照射的HONE-1R和HONE-1細(xì)胞,HONE-1R細(xì)胞生存率顯著高于HONE-1細(xì)胞的生存率(P0.05);HONE-1R細(xì)胞遷移力、侵襲能力均較HONE-1細(xì)胞顯著增加(P0.05)。(3)鼻咽癌組織ATF5蛋白表達(dá)水平顯著高于鼻咽正常組織表達(dá)水平(P均0.05),亞細(xì)胞主要定位于細(xì)胞漿;局部復(fù)發(fā)鼻咽癌組織ATF5蛋白表達(dá)水平顯著高于初發(fā)鼻咽癌組織(P=0.032),且亞細(xì)胞主要定位于細(xì)胞核。(4)X線能促進(jìn)鼻咽癌HONE-1細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)且呈劑量依賴性誘導(dǎo)EMT分子標(biāo)志物(E-cadherin、N-cadherin)表達(dá)改變;(5)shRNA-ATF5能顯著下調(diào)HONE-1R細(xì)胞ATF5 mRNA表達(dá)水平(P0.05),降低HONE-1R細(xì)胞克隆形成率(P0.05),削弱HONE-1R細(xì)胞存活率、遷移力和侵襲力(P均0.05),抑制HONE-1R放射抗拒性(P0.05),且顯著上調(diào)HONE-1R細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)(P0.05),下調(diào)HONE-1R細(xì)胞N-cadherin蛋白表達(dá)(P0.05)。結(jié)論:(1)ATF5參與HONE-1細(xì)胞放射抵抗,且HONE-1放射抵抗細(xì)胞發(fā)生EMT變化。(2)ATF5沉默可逆轉(zhuǎn)鼻咽癌放療抵抗細(xì)胞的EMT表型,增加鼻咽癌放療抵抗細(xì)胞的放療敏感性,提示ATF5蛋白可能通過介導(dǎo)EMT參與鼻咽癌放療抵抗。
【圖文】：

科大學(xué)碩士學(xué)位論文 帥結(jié)果X 線對 HONE-1 細(xì)胞 ATF5 蛋白表達(dá)的影響疫細(xì)胞化學(xué)法檢測結(jié)果顯示： X 線（10Gy、20Gy、30Gy、40Gy、50Gy割照射能促進(jìn) HONE-1 細(xì)胞 ATF5 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，且其表達(dá)水平隨劑量的增加而增加（P 均＜0.05，圖 1、圖 2、表 14）；ATF5 在 HONE細(xì)胞定位也發(fā)生改變，由細(xì)胞漿轉(zhuǎn)向細(xì)胞核，，主要表現(xiàn)為細(xì)胞核表達(dá)顯細(xì)胞免疫熒光法檢測結(jié)果也顯示：HONE-1 細(xì)胞 ATF5 蛋白主要定位于其免疫熒光強(qiáng)度隨 X 線照射劑量的增加而增強(qiáng)（圖 1）。

圖 3 不同照射劑量對各組細(xì)胞生存率影響Fig.3 Effect of different irradiation doses on the survival rate of each groupNote：*P＜0.05，（ x±s，n=3）克隆形成實(shí)驗(yàn)著 X 線照射劑量（0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy）增加，細(xì)胞量逐漸減少；在相同照射劑量下，HONE-1R 細(xì)胞的存活克隆數(shù)1 細(xì)胞的克隆數(shù)量增加（圖 4、圖 5）。單擊多靶模型擬合細(xì)胞存活HONE-1R 細(xì)胞 SF2值（0.786±0.05）是 HONE-1 細(xì)胞（0.459±0.03，HONE-1R 細(xì)胞 D0（1.248±0.164）是 HONE-1 細(xì)胞（1.096±0.127，HONE-1R 細(xì)胞 Dq（2.373±0.226）是 HONE-1 細(xì)胞（1.368±0.149（圖 6、表 15）。
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R739.63

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本文編號：2605029