【摘要】：目的:本課題的研究目的在于通過(guò)干擾SERPINB6基因在鼻咽癌CNE-1細(xì)胞中的表達(dá),然后觀察該基因表達(dá)降低對(duì)CNE-1細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的影響,以及對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移蛋白MMP-2活性的影響,并分析它的表達(dá)降低在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用,進(jìn)一步揭示鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制,為臨床診斷提供理論依據(jù),也為以SERPINB6作為潛在靶點(diǎn)的NPC基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1.采用人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞株作為研究對(duì)象進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),首先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn),預(yù)實(shí)驗(yàn)分五組:mock組(空白組A)、N.C-siRNA組(陰性對(duì)照組B)和siRNA-SERPNB6-1組(實(shí)驗(yàn)組C)、siRNA-SERPINB6-2 組(實(shí)驗(yàn)組 D)、siRNA-SERPINB6-3 組(實(shí)驗(yàn)組E).2.通過(guò)使用普通siRNA經(jīng)濟(jì)型套餐,對(duì)CNE-1細(xì)胞進(jìn)行SERPINB6的轉(zhuǎn)染小干擾,檢測(cè)轉(zhuǎn)染率(NC-FAM);實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)5組細(xì)胞中SERPINB6的表達(dá)情況,并篩選出干擾效果最佳一組,作為后續(xù)的正式實(shí)驗(yàn)。3.正式實(shí)驗(yàn)分三組:mock組(空白組A)、N.C-siRNA組(陰性對(duì)照組B)和siRNA-SERPINB6組(實(shí)驗(yàn)組C,干擾最佳)。MTT法檢測(cè)被干擾后的SERPINB6對(duì)NPCCNE-1細(xì)胞增殖活性的影響;劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)被干擾后的SERPINB6對(duì)NPCCNE-1細(xì)胞遷移能力的影響;Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)被干擾后的SERPINB6對(duì)NPCCNE-1.細(xì)胞侵襲能力的影響。4.WB檢測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MPP-2的表達(dá)情況。結(jié)果:1.在預(yù)實(shí)驗(yàn)中,轉(zhuǎn)染siRNA后,RT-PCR法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組CDE的SERPINB6相對(duì)表達(dá)量比陰性對(duì)照組和空白組明顯下降(P0.05)。轉(zhuǎn)染siRNA3序列即實(shí)驗(yàn)組C下降最明顯(P0.01),干擾效果最佳,說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)成功干擾SERPINB6,故后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用實(shí)驗(yàn)組C的siRNA3 序列。2.在正式實(shí)驗(yàn)中,每隔24小時(shí)用MTT法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組的增殖速度分別是 0.184±0.017、0.278土0.019、0.389±0.023,較陰性對(duì)照組和空白組細(xì)胞生長(zhǎng)增大明顯。(P0.05)。3.劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果示轉(zhuǎn)染了 si-RNA的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移距離明顯快于陰性對(duì)照組和空白組。(p0.05)。4.Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組5個(gè)視野下的侵襲細(xì)胞平均值為135,較陰性對(duì)照組和空白組進(jìn)入下層小室的細(xì)胞數(shù)明顯增多,侵襲能力明顯增強(qiáng)。(P0.05)。5.Western Blot法顯示實(shí)驗(yàn)組中MMP-2的蛋白活化水平明顯升高,高于陰性對(duì)照組和空白組。(P0.05)。結(jié)論:1.SERPINB6能夠抑制CNE-1細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,可為基因治療提供新的靶點(diǎn)依據(jù)。2.外源性轉(zhuǎn)染si-SERPINB6促進(jìn)CNE-1細(xì)胞的遷移與侵襲,腫瘤轉(zhuǎn)移蛋白MMP-2的活化表達(dá)水平升高,SERPINB6可能是通過(guò)介導(dǎo)MMPS活化參與CNE-1細(xì)胞的轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)。
【圖文】：

３．３正式實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞的培養(yǎng)及生長(zhǎng)逡逑細(xì)胞分組：ＣＮＥ－１＋ｍｏｃｋ組（空白組Ａ）、ＣＮＥ－１＋Ｎ．Ｃ－ｓｉＲＮＡ組（陰性對(duì)逡逑照組Ｂ）和ＣＮＥ－】＋邋ｓｉＲＮＡ－ＳＥＲＰ丨ＮＢ６組（實(shí)驗(yàn)組Ｃ，干擾最佳）。培養(yǎng)４８ｈ后，逡逑１６逡逑

３．３正式實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞的培養(yǎng)及生長(zhǎng)逡逑細(xì)胞分組：ＣＮＥ－１＋ｍｏｃｋ組（空白組Ａ）、ＣＮＥ－１＋Ｎ．Ｃ－ｓｉＲＮＡ組（陰性對(duì)逡逑照組Ｂ）和ＣＮＥ－】＋邋ｓｉＲＮＡ－ＳＥＲＰ丨ＮＢ６組（實(shí)驗(yàn)組Ｃ，干擾最佳）。培養(yǎng)４８ｈ后，，逡逑１６逡逑
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R739.63

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本文編號(hào)：2603014