【摘要】：研究背景：葡萄膜炎是一類嚴重威脅視力的眼病,Behcet病(BD)和Vogt-小柳原田綜合征(VKH syndrome)是葡萄膜炎中兩種常見的疾病類型。BD目前認為是一種慢性炎癥性疾病,常累及全身多個器官。臨床主要表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的口腔潰瘍及生殖器潰瘍、非肉芽腫性葡萄膜炎、結(jié)節(jié)性紅斑、皮膚損害等。VKH綜合征是一種自身免疫性疾病,常伴有全身多系統(tǒng)受累。雙側(cè)肉芽腫性葡萄膜炎是眼部的主要表現(xiàn),眼外常表現(xiàn)為頭痛、脫發(fā)、毛發(fā)變白、聽力下降、白癜風(fēng)等。補體系統(tǒng)已被證實在固有免疫和適應(yīng)性免疫中都發(fā)揮著重要作用。補體激活途徑包括以下三種：經(jīng)典途徑、旁路途經(jīng)和MBL途徑。共同路徑是C3激活、C5裂解,啟動級聯(lián)反應(yīng),形成攻膜復(fù)合物(MAC),誘導(dǎo)組織炎癥反應(yīng)的發(fā)生,造成組織細胞的損傷,參與自身免疫性疾病或自身炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展。近年來研究顯示補體系統(tǒng)參與了實驗誘導(dǎo)性葡萄膜炎(EAU)的發(fā)生發(fā)展,但補體C3,C5-C9基因拷貝數(shù)變異及基因多態(tài)與BD和VKH綜合征是否相關(guān)尚未見報道。因此我們對補體C3,C5-C9基因拷貝數(shù)變異及基因多態(tài)在BD和VKH綜合征里進行遺傳易感性研究。第一部分補體基因拷貝數(shù)變異在Behcet病、VKH綜合征中的遺傳易感性研究目的：既往研究證實補體參與了多種自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。本次研究探討補體C3,C5,C6,C7,C8A,C8B和C9的基因拷貝數(shù)變異與BD、VKH綜合征的遺傳相關(guān)性。方法：實驗分為2個階段,第一階段包括382例BD患者、383例VKH綜合征患者和573例正常對照。第二階段包括682例BD患者、676例VKH綜合征患者和1601例正常對照。實時熒光定量PCR (RT-PCR)檢測基因拷貝數(shù)和mRNA的表達。分層分析基因拷貝數(shù)變異與BD和VKH綜合征主要臨床癥狀的關(guān)系。ELISA檢測正常人不同基因拷貝數(shù)分型后外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)培養(yǎng)上清中細胞因子IL-17,IFN-γ,IL-10,IL-8,TNF-α,IL-6,IL-1β和MCP-1的水平。結(jié)果：補體C3基因拷貝數(shù)大于2的頻率在BD患者、VKH綜合征患者和正常對照組之間于第一階段存在統(tǒng)計學(xué)差異(Pc=5.5×10-,OR=3.4,95%CI=1.7-6.8；Pc=0.018,OR=3.1,95%CI=1.5-6.3)；C5基因拷貝數(shù)大于2的頻率在BD患者和對照組之間在第一階段存在統(tǒng)計學(xué)差異(Pc=3.3×10-4,OR=7.7,95% CI=2.2-26.9)。第二階段獨立大樣本驗證,發(fā)現(xiàn)C3基因拷貝數(shù)大于2的頻率在病例組(BD、VKH綜合征)和正常對照組之間比較得到與第一階段類似的結(jié)果,兩階段結(jié)果合并在一起聯(lián)合分析后發(fā)現(xiàn)C3在BD患者、VKH綜合征患者中基因拷貝數(shù)大于2的頻率比正常對照組顯著升高,統(tǒng)計學(xué)差異顯著(Pc=5.3×10-9,OR=3.0,95% CI=2.1-4.3；Pc=6.4×10-8,OR=2.8,95%CI=1.9-4.1)。C5基因拷貝數(shù)變異在第二階段得到與第一階段類似的結(jié)果,兩個階段結(jié)果合并后統(tǒng)計學(xué)差異明顯,C5在BD患者中基因拷貝數(shù)大于2的頻率比正常對照組明顯升高(Pc=1.1×10-,OR=3.4,95%CI=2.2-5.1)。補體C3,C5基因拷貝數(shù)大于2的正常人PBMC表達的mRNA分別依次高于各自基因拷貝數(shù)等于2和小于2的mRNA表達(Pc=0.015,Pc=0.018；Pc=0.039,Pc=0.0006)。正常人PBMC根據(jù)不同基因拷貝數(shù)分型后經(jīng)LPS或抗-CD3/CD28抗體刺激并培養(yǎng),收集PBMCs培養(yǎng)上清,檢測細胞因子濃度,發(fā)現(xiàn)IL-17和IFN-γ在C3拷貝數(shù)大于2的正常人PBMCs培養(yǎng)上清中的濃度明顯升高,與拷貝數(shù)等于2或小于2比較,存在統(tǒng)計學(xué)差異(Pc=0.01,Pc=0.001；Pc=0.003,Pc=0.002)；IL-17在C5拷貝數(shù)大于2的正常人PBMCs培養(yǎng)上清中的濃度升高,與拷貝數(shù)等于2或小于2比較,存在統(tǒng)計學(xué)差異(Pc=0.002,Pc=0.0002)。結(jié)論：本研究證明補體C3基因拷貝數(shù)變異與BD、VKH綜合征相關(guān),補體C5基因拷貝數(shù)變異與BD相關(guān)。第二部分 補體基因多態(tài)在Behcet病、VKH綜合征中的遺傳易感性研究目的：研究補體C3,C5基因多態(tài)與BD、VKH綜合征的相關(guān)性。方法：實驗分為兩個階段,第一階段包括376例BD患者、373例VKH綜合征和562例正常對照；第二階段包含572例BD患者以及807例正常對照。一共10個SNP(C3：rs408290,rs7951,rs344555,rs2250656,rs432001,rs2241394；C5：rs2269067,rs7040033,rs1017119,rs7027797)參與本次研究�；蚨鄳B(tài)性分型采用探針(TaqMan分型)或PCR-RFLP方法。病例組和對照組的等位基因頻率、基因型頻率比較采用卡方檢驗。RT-PCR檢測mRNA的表達。ELISA檢測細胞因子IL-17,IFN-γ,IL-10,IL-8,TNF-α,IL-6,IL-1β和MCP-1的水平。結(jié)果：C3 rs408290在第一階段顯示GG基因型頻率在BD患者和對照組之間存在明顯差異(Pc=8.6×10-,OR=2.0,95% CI=1.38-3.10),C3基因另外5個SNP的基因型和等位基因頻率在BD患者和對照組之間無統(tǒng)計學(xué)差異,C3的6個SNP其基因型和等位基因頻率在VKH綜合征和正常人之間無統(tǒng)計學(xué)差異；在第二階段,其GG型和CG型的頻率在Behcet病患者和對照組間差異明顯(Pc=3.7×10-4,OR=2.92,95% CI=1.76-4.83；Pc=1.5×10-3,OR=0.61,95% CI=0.48-0.78)；兩階段結(jié)果匯總后分析確認了統(tǒng)計學(xué)差異(Pc=1.5×10-7,OR=2.31,95% CI=1.69-3.16；Pc=4.9x10-4,OR=0.68,95%CI=0.57-0.81)。C5 rs2269067的GG基因型頻率在第一和第二階段得到類似的結(jié)果,都表現(xiàn)為GG型頻率在BD患者明顯升高,且有統(tǒng)計學(xué)差異,兩階段匯總結(jié)果證實rs2269067 GG型頻率與正常對照的差異性(Pc=1.3×10-,OR=1.73,95% CI=1.45-2.06),C5另外3個SNP的基因型和等位基因頻率在Behcet病患者和正常人之間無統(tǒng)計學(xué)差異,C5的4個SNP的基因型和等位基因頻率在VKH綜合征和正常人之間無統(tǒng)計學(xué)差異。C3 rs408290和C5 rs2269067的GG型對應(yīng)正常人外周血單核細胞的mRNA表達分別與CG型和CC型對應(yīng)正常人外周血單核細胞中的mRNA表達比較后有統(tǒng)計學(xué)差異(Pc=1.5×10-4,Pc=2.5×10-；Pc=0.009,Pc=0.002)。C3 rs408290 GG型對應(yīng)的正常人PBMCs培養(yǎng)上清中IL-17和IFN-y的表達水平分別與CG型或CC型對應(yīng)正常人PBMCs培養(yǎng)上清中的細胞因子比較,發(fā)現(xiàn)有顯著性差異(Pc=8.5×10-5,Pc=2.3×10-5；Pc=0.015,Pc=0.001),其他6種細胞因子表達水平在C3 rs408290三種基因型間無統(tǒng)計學(xué)差異。C5 rs2269067的GG型對應(yīng)正常人外周血單核細胞培養(yǎng)上清中IL-17的表達水平與CG型或CC型對應(yīng)正常人外周血單核細胞培養(yǎng)上清的IL-17表達水平比較發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)差異(分別為Pc=0.021,Pc=0.006),其他6種細胞因子在C5 rs2269067三種基因型間無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論：本研究證實補體C3、C5基因多態(tài)與BD相關(guān)。
【圖文】：

圖２N６補體Ｃ８Ｂ擴靖巧線逡逑Ｆｉ２．１．６邋Ａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｃｕｒｖｅ邋ｏｆ邋Ｃｏｍｌｅｍｅｎｔ邋Ｃ８Ｂ逡逑

ＰＢＭＣ培養(yǎng)上清中細胞因子ＩＦＮ－丫和心１７的濃度比ＣＧ型和ＣＣ型對應(yīng)的細胞因逡逑子濃度明顯升高（Ｐ邋＝邋0．0１５，Ｐ邋＝邋０．00１；Ｐ＝８．＾１0－５，，Ｐ＝２．３ｘ１0－５）。其他邋６邋種細胞因逡逑子濃度在Ｈ種基因型間顯示無統(tǒng)計學(xué)差異。如圖２．４和２．５所示。逡逑６８逡逑
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R773

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本文編號：2574269