【摘要】：本論文擬通過小鼠視網(wǎng)膜光損傷的病理研究、P2x4和TRPV1受體在BBR抗視網(wǎng)膜光損傷作用研究,探索BBR抗視網(wǎng)膜光損傷作用機(jī)制。一:小鼠視網(wǎng)膜光損傷的病理研究研究目的:在前期研究發(fā)現(xiàn)小檗堿具有抗小鼠視網(wǎng)膜光損傷的基礎(chǔ)上,運(yùn)用前期實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?分析小鼠視網(wǎng)膜光損傷后的病理變化,以為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。研究方法:選用健康清潔級C57BL/6J小鼠,隨機(jī)分為空白組和LD組兩組,每組各3只。LD組小鼠在自制光損傷箱中給予10000±1500Lux、4小時的光照。造模48h后,摘取右眼于4%多聚甲醛固定液中固定,摘取左眼并提取視網(wǎng)膜。HE染色測量視網(wǎng)膜ONL層厚度,觀察光損傷對視網(wǎng)膜形態(tài)的影響。Tunel-POD檢測法觀察兩組視網(wǎng)膜ONL層細(xì)胞凋亡的情況。研究結(jié)果:1.HE染色觀察視網(wǎng)膜形態(tài),結(jié)果顯示:空白組視網(wǎng)膜形態(tài)正常,各層結(jié)構(gòu)層次分明:神經(jīng)節(jié)細(xì)胞核排列整齊;內(nèi)核層、外核層細(xì)胞核排列緊密,染色均勻,細(xì)胞核形態(tài)完整;光感受器細(xì)胞內(nèi)外節(jié)排列規(guī)則,分界清晰。LD組視網(wǎng)膜部分神經(jīng)節(jié)細(xì)胞核縮小,染色加深,疏松樣排列;內(nèi)核層細(xì)胞核排列緊密、整齊;外核層細(xì)胞核排列紊亂,部分細(xì)胞核濃縮、聚集、染色加深;光感受器細(xì)胞內(nèi)、外節(jié)排列稍紊亂,視桿外節(jié)排列紊亂,膜盤間隙部分?jǐn)嗔�。LD組視網(wǎng)膜ONL層變薄。2.TUNEL觀察小鼠視網(wǎng)膜ONL層細(xì)胞凋亡情況:空白組小鼠視網(wǎng)膜組織未見細(xì)胞凋亡,光照48h后LD組小鼠視網(wǎng)膜組織中出現(xiàn)大量的細(xì)胞凋亡,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。第二部分P2x4受體在BBR抗視網(wǎng)膜光損傷的作用機(jī)制研究研究目的:在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,進(jìn)一步從嘌呤信號P2x4受體角揭示小檗堿抗視網(wǎng)膜光損傷的作用機(jī)制,為臨床小檗堿治療老年性黃斑變性等視網(wǎng)膜光損傷疾病提供科學(xué)依據(jù)。研究方法:選用健康清潔級C57BL/6J小鼠,隨機(jī)分為三組,分別為空白組、LD組和BBR組,每組各6只。BBR組小鼠給予200mg/Kg濃度的BBR溶液灌胃,空白組及LD組每天給予PBS灌胃。7天后,LD組和BBR組均給予10000± 1500Lux、4小時的光照。光照后繼續(xù)灌胃,并在光照48h后,摘取右眼于4%多聚甲醛固定液中固定切片,摘取左眼并取視網(wǎng)膜以提取RNA。采用Q-PCR技術(shù)檢測小鼠視網(wǎng)膜中P2x4的表達(dá)情況。并采用免疫熒光雙標(biāo)法觀察檢測小鼠視網(wǎng)膜ONL層中小膠質(zhì)細(xì)胞與P2x4陽性表達(dá)情況。研究結(jié)果:1.Q-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與空白組比較,LD組視網(wǎng)膜P2rx4mRNA表達(dá)下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與LD組比較,BBR組視網(wǎng)膜的P2rx4 mRNA表達(dá)上調(diào),其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.免疫熒光雙標(biāo)觀察視網(wǎng)膜ONL層小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量及P2x4陽性表達(dá)情況顯示:結(jié)果觀察到小膠質(zhì)細(xì)胞和P2x4標(biāo)記物在視網(wǎng)膜中存在共定位,但數(shù)量較少,每個視野僅數(shù)個。與空白組比較,LD組ONL層小膠質(zhì)細(xì)胞增多,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與LD組比較,BBR組ONL層小膠質(zhì)細(xì)胞降低,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與空白組比較,LD組視網(wǎng)膜ONL層P2x4的表達(dá)增高,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與LD組比較,BBR組視網(wǎng)膜ONL層P2x4的表達(dá)降低,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。第三部分TRPV1受體在BBR抗視網(wǎng)膜光損傷作用的研究研究目的:從TRPV1受體角度探索小檗堿抗視網(wǎng)膜光損傷的作用,為臨床小檗堿治療老年性黃斑變性等視網(wǎng)膜光損傷疾病提供科學(xué)依據(jù)。研究方法:選用同種系野生小鼠C57BL/6小鼠及TRPV1基因敲除(TRPV1 KO)小鼠,隨機(jī)分為三組,分別為空白組、LD組和BBR組,每種系小鼠每組各6只。BBR組小鼠給予200mg/Kg濃度的BBR溶液灌胃,空白組及LD組每天給予PBS灌胃。7天后,LD組和BBR組均給予10000± 1500Lux、4小時的光照。光照后繼續(xù)灌胃,并在光照48h后,摘取右眼于4%多聚甲醛固定液中固定,摘取左眼并提取視網(wǎng)膜。分別用HE、TUNEL觀察視網(wǎng)膜ONL層厚度及細(xì)胞凋亡情況。采用Q-PCR技術(shù)檢測野生小鼠C57BL/6小鼠視網(wǎng)膜中TRPV1的表達(dá)情況。研究結(jié)果:1.HE染色法分別觀察三組小鼠視網(wǎng)膜形態(tài),結(jié)果顯示:空白組視網(wǎng)膜形態(tài)正常,各層結(jié)構(gòu)層次分明;神經(jīng)節(jié)細(xì)胞核排列整齊;內(nèi)核層、外核層細(xì)胞核排列緊密,染色均勻,細(xì)胞核形態(tài)完整;光感受器細(xì)胞內(nèi)外節(jié)排列規(guī)則,分界清晰。LD組部分神經(jīng)節(jié)細(xì)胞核縮小,染色加深,疏松樣排列;內(nèi)核層細(xì)胞核排列緊密、整齊;外核層細(xì)胞核排列紊亂,部分細(xì)胞核濃縮、聚集、染色加深;光感受器細(xì)胞內(nèi)、外節(jié)排列稍紊亂,視桿外節(jié)排列紊亂,膜盤間隙部分?jǐn)嗔�。BBR組視網(wǎng)膜形態(tài)略有異常,結(jié)構(gòu)層次分明:神經(jīng)節(jié)細(xì)胞核排列稍稀疏;內(nèi)核層、外核層細(xì)胞核排列緊密,染色均勻,細(xì)胞核形態(tài)完整;光感受器細(xì)胞內(nèi)外節(jié)排列稍紊亂。LD組小鼠光照48h后,外核層厚度變薄;BBR灌胃組小鼠視網(wǎng)膜外核層厚度比LD組厚。TRPV1WT小鼠模型組和正常相比,厚度降低17.11%;BBR治療后,和模型組相比,外核層厚度增加17.37%。TRPV1KO小鼠模型組和正常相比,厚度降低20.51%;BBR治療后,和模型組相比,外核層厚度增加28.90%�；蚯贸∈驩NL層厚度比野生型小鼠薄,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),基因敲除對ONL層厚度變化無明顯影響。2.TUNEL觀察小鼠視網(wǎng)膜ONL層細(xì)胞凋亡情況顯示:空白組小鼠視網(wǎng)膜組織未見細(xì)胞凋亡;光照48h后LD組小鼠視網(wǎng)膜組織中出現(xiàn)TUNEL陽性細(xì)胞表達(dá),呈棕黃色染色,陽性細(xì)胞核皺縮;BBR組小鼠視網(wǎng)膜組織見少量細(xì)胞凋亡。與空白組比較,LD組ONL層中凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多,二者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);BBR組ONL層凋亡細(xì)胞數(shù)量略有增高,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);與LD比較,BBR組ONL層中凋亡細(xì)胞數(shù)量降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。ONL層細(xì)胞凋亡率對比,基因敲除小鼠比野生型小鼠高,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);但是,BBR組中基因敲除小鼠細(xì)胞凋亡率比野生型高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)�；蚯贸龑NL層細(xì)胞凋亡有影響。3.Q-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與空白組比較,LD組視網(wǎng)膜TRPV1mRNA表達(dá)下調(diào),其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);LD組視網(wǎng)膜TRPV1mRNA表達(dá)下調(diào),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與模型組比較,灌胃組小鼠的TRPV1mRNA表達(dá)上調(diào),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。研究結(jié)論:1.BBR具有較好的抗視網(wǎng)膜光損傷的作用。2.P2x4受體,可能會通過調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞,參與BBR抗視網(wǎng)膜光損傷的作用。3.TRPV1受體具有一定的視網(wǎng)膜保護(hù)作用,是視網(wǎng)膜光損傷的重要病理機(jī)制,并可能參與了 BBR抗視網(wǎng)膜光損傷作用。
【學(xué)位授予單位】：中國中醫(yī)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R774.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 鄭桂芝;李晗;吳煥淦;馬曉們;方臻臻;馬U，

本文編號：2574175