【摘要】：目的：探討脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cell, AMSC)聯(lián)合類內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial-like cell, ELC)或人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vascular endothelial cell, HUVEC)移植對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)大鼠的血-視網(wǎng)膜屏障(blood-retinal barrier, BRB)的影響及作用機(jī)制；評(píng)價(jià)不同劑量的AMSC移植治療DR大鼠的效果。方法：以鏈脲佐菌素腹腔注射法建立Wistar大鼠糖尿病動(dòng)物模型。于注射后7個(gè)月(30周)時(shí),隨機(jī)抽選大鼠行視網(wǎng)膜血管網(wǎng)消化鋪片以明確DR血管性損傷的發(fā)生。原代分離、培養(yǎng)AMSCs和HUVECs,流式細(xì)胞儀進(jìn)行鑒定。將AMSCs置于內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分化得到ELCs。DR大鼠隨機(jī)分組：未治療組、誘導(dǎo)組(AMSCs +ELCs)、聯(lián)合組(AMSCs+HUVECs)、高劑量組(AMSCs)及低劑量組(AMSCs),經(jīng)尾靜脈注射行細(xì)胞干預(yù)。于干預(yù)后2、4周,Evans blue滲漏實(shí)驗(yàn)評(píng)估大鼠的BRB功能；HE染色評(píng)估大鼠視網(wǎng)膜水腫度；qPCR及Western-blot檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞間黏附分子-1 (intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、促血管生成素-2(angiopoietin-2, Ang-2)的表達(dá)；免疫組織化學(xué)及共聚焦熒光染色觀察移植細(xì)胞向視網(wǎng)膜的歸巢；心、肝、脾、胰、腎的HE及免疫組織化學(xué)染色評(píng)估細(xì)胞移植的安全性。結(jié)果：1)DR模型：7個(gè)月時(shí),糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜血管網(wǎng)消化鋪片可見閉鎖的無細(xì)胞性毛細(xì)血管,DR大鼠模型建成。2)細(xì)胞培養(yǎng)：原代培養(yǎng)的AMSCs及誘導(dǎo)而來的ELCs均為成纖維細(xì)胞樣。原代培養(yǎng)的HUVECs為鋪路石樣排列的多角形細(xì)胞,高表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志分子CD31(99.52%)和vWF(99.63%)。3) BRB功能試驗(yàn)：干預(yù)后2周,與未治療組相較,僅誘導(dǎo)組及低劑量組的Evans blue滲漏量有所減輕,BRB功能有改善。干預(yù)后4周,其余各干預(yù)組的BRB功能均較誘導(dǎo)組的為好。3) 分子表達(dá)：干預(yù)后2周,與未治療組相較,僅低劑量組的ICAM-1蛋白水平有所下降；誘導(dǎo)組的ICAM-1及VEGF的基因轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)均有所上升；各組之間Ang-2的基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。干預(yù)后4周,與未治療組相較,各干預(yù)組的ICAM-1蛋白表達(dá)均有所下降；低劑量組的VEGF的基因轉(zhuǎn)錄水平有所上升,但VEGF蛋白表達(dá)有所下降；誘導(dǎo)組的VEGF的基因轉(zhuǎn)錄水平有所上升,蛋白水平無明顯變化；各組之間Ang-2的基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4)視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)：標(biāo)化灰度值分析結(jié)果示,干預(yù)后2周,與未治療組視網(wǎng)膜對(duì)應(yīng)層次對(duì)比,僅低劑量組的外核層和視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層水腫度有所減輕。干預(yù)后4周,與未治療組視網(wǎng)膜對(duì)應(yīng)層次相較,各干預(yù)組的外核層、除外誘導(dǎo)組的各干預(yù)組的內(nèi)核層、聯(lián)合組及高劑量組的內(nèi)叢狀層的水腫度均有所減輕。5)細(xì)胞歸巢：免疫組織化學(xué)染色及共聚焦結(jié)果示,人源細(xì)胞在視網(wǎng)膜上散在分布,可能與視網(wǎng)膜血管有密切關(guān)系。6)移植安全性：HE染色鏡下可見糖尿病腎病改變及腎臟多發(fā)腫瘤。僅聯(lián)合組可以見到大量腎小管細(xì)胞管型。胰腺的胰島細(xì)胞數(shù)目有所減少。心、肝、脾的結(jié)構(gòu)大致正常。免疫組化結(jié)果示人源細(xì)胞密集于大鼠的脾臟和腎臟腫瘤周圍,可見于肝臟匯管區(qū),偶見于腎小管管壁和聯(lián)合組的腎小管管腔。結(jié)論：AMSCs能夠改善DR大鼠的BRB功能,該作用可能是通過抗炎作用來實(shí)現(xiàn)。單純低劑量AMSCs治療組能夠更快改善DR大鼠的BRB功能。單純AMSCs注射治療DR的效果優(yōu)于聯(lián)合ELCs組。
【圖文】：

圖１－２－４－１：視網(wǎng)膜流水沖洗過夜圖邐１－２－４－２：消化后鋪展開的視網(wǎng)膜血管網(wǎng)逡逑（左上小圖中紅色箭頭示大鼠視網(wǎng)膜）逡逑

圖１－３－３－１：視網(wǎng)膜血管網(wǎng)鋪片肥染色（１００Ｘ）左，，大血管旁毛細(xì)血管網(wǎng)（藍(lán)色箭頭示閉鎖的逡逑毛細(xì)血管，植色箭頭示周細(xì)胞）；中，中等血管旁的毛細(xì)血管網(wǎng)（藍(lán)色箭頭示閉鎖的毛細(xì)血管，逡逑紅色箭頭示毛細(xì)血管間橋）；右，終末毛細(xì)血管網(wǎng)（藍(lán)色箭頭示閉鎖的毛細(xì)血管，紅色箭頭示逡逑擴(kuò)張的無細(xì)胞毛細(xì)血管）。注：由于毛細(xì)血管管壁乏光滑感，很難認(rèn)定影周細(xì)胞（文獻(xiàn)中提及逡逑的影周細(xì)胞為微突出于毛細(xì)血管管壁無細(xì)胞核的周細(xì)胞），故圖中不再標(biāo)出。逡逑１．邋４討論逡逑１．４．１糖尿病建模方法的選擇逡逑臨床上糖尿病分為：Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病和其它特異性糖尿�。郏玻荨＃尚吞清义夏虿〉幕静∽�?yōu)槟uＰ細(xì)胞破壞所致的膜島素絕對(duì)性缺乏。ＩＩ型糖尿病的基本病逡逑變?yōu)榘驆u素抵抗合并族島素分泌不足。其它特異性糖尿病包括：Ｐ細(xì)胞功能的基因逡逑缺陷、族島素作用的基因缺陷、感染、藥物或化學(xué)制劑所致的糖尿病等。逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R587.2;R774.1

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2 祝~=驤;iJ梊霞;洃克琴;崔素英;文允摪;

本文編號(hào)：2566200