【摘要】：目的：國內(nèi)外大量研究表明，Wnt/β-catenin信號通路與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展存在密切的關(guān)系。Chibby為近年來新發(fā)現(xiàn)的該信號通路拮抗劑，通過對β-catenin的抑制，拮抗異常Wnt信號，可能是潛在的腫瘤抑制因子。已有研究表明Chibby與多種腫瘤的發(fā)生存在一定的關(guān)系，但尚無Chibby與喉癌關(guān)系的研究報道。本研究旨在從表達(dá)及功能層面系統(tǒng)闡述Chibby與喉癌的關(guān)系，為進(jìn)一步研究Wnt/β-catenin信號通路在喉癌發(fā)病中的作用機(jī)制，尋找新的作用靶標(biāo)，為喉癌的基因治療奠定基礎(chǔ)。 方法： 1、分別采用Real-time PCR方法及免疫組織化學(xué)方法（SP法）檢測喉癌組織與相應(yīng)癌旁正常喉粘膜中Chibby mRNA及蛋白的表達(dá)變化。應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS17.0統(tǒng)計分析腫瘤組織中Chibby mRNA及蛋白的表達(dá)差異與喉癌患者不同年齡、性別、臨床分期及腫瘤分化程度間的關(guān)系。 2、通過GeneBank檢索人類Chibby mRNA編碼序列，應(yīng)用引物設(shè)計軟件Primer premier5設(shè)計引物獲取目的片段，經(jīng)XbaⅠ/MIuⅠ雙酶切后構(gòu)建重組質(zhì)粒plv-cs2.0-Cby。利用脂質(zhì)體（TurboFect）法進(jìn)行慢病毒包裝獲取病毒上清。采用相同滴度的病毒上清感染喉癌細(xì)胞系Hep-2，經(jīng)Puro篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)Chibby的Hep-2細(xì)胞系，分別采用Real time PCR方法及Western blot方法檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中Chibby的過表達(dá)效率。 3、分別采用MTT法檢測細(xì)胞增殖能力；平板克隆形成實驗檢測細(xì)胞克隆形成能力；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布；Tunel染色檢測細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果： 1、與正常喉粘膜相比較，喉癌組織中Chibby mRNA及蛋白表達(dá)的降低率分別為56.67%（17/30）及80.00%（24/30），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）。喉癌組織中Chibby mRNA及蛋白的表達(dá)差異與患者的性別、年齡、臨床分期及腫瘤分化程度間無明顯關(guān)系（p＞0.05）。 2、目的基因PCR擴(kuò)增得到421bp大小的目的片段，重組質(zhì)粒經(jīng)XbaⅠ/MIuⅠ雙酶切后得到8750bp及414bp大小的基因片段，經(jīng)XbaⅠ/KpnⅠ雙酶切后得到6886bp、1384bp及894bp大小的基因片段，均與理論大小相符，序列測定與Genebank公布一致。經(jīng)Real time PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)Chibby mRNA過表達(dá)了276.92倍（p＜0.01），經(jīng)Western blot方法檢測發(fā)現(xiàn)過表達(dá)了外源Chibby蛋白，未見內(nèi)源Chibby蛋白條帶，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.01）。 3、與control組及plv-cs2.0組細(xì)胞相比較，plv-cs2.0-Cby組細(xì)胞增值能力減弱，且隨著時間延長，減弱越明顯（P＜0.05）。plv-cs2.0-Cby組細(xì)胞的克隆形成數(shù)及克隆面積明顯低于control組與plv-cs2.0組（P＜0.01）。流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，plv-cs2.0-Cby組細(xì)胞滯留在G1期；而S細(xì)胞明顯減少（P＜0.05）。TUNEL染色發(fā)現(xiàn)，相對于control組及plv-cs2.0組， plv-cs2.0-Cby組的凋亡比例明顯增加（P＜0.01）。而control組與plv-cs2.0組細(xì)胞間的增值能力、克隆形成能力、細(xì)胞周期分布及凋亡比例無差異（P＞0.05）。 結(jié)論： 1、與正常喉粘膜相比較，喉癌組織中Chibby mRNA及蛋白的表達(dá)水平均降低，未發(fā)現(xiàn)喉癌組織中Chibby mRNA及蛋白的表達(dá)差異與患者的性別、年齡、臨床分期及腫瘤分化程度間存在相關(guān)關(guān)系。 2、酶切鑒定及序列測定結(jié)果顯示，成功構(gòu)建了plv-cs2.0-Cby慢病毒真核過表達(dá)載體，經(jīng)慢病毒包裝及感染喉癌細(xì)胞系Hep-2后，在Hep-2中有效的過表達(dá)了外源Chibby，為功能實驗奠定了基礎(chǔ)。 3、過表達(dá)Chibby后，有效的抑制了喉癌細(xì)胞系Hep-2的增值能力及克隆形成能力，將Hep-2細(xì)胞滯留在G1期，促使了Hep-2細(xì)胞的凋亡。因此，過表達(dá)Chibby有望成為喉癌靶向基因治療的有效手段。
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只有這兩種機(jī)制共同作用才能有效的抑制Wnt信號通路的活性【12】（見圖1）。另外，還需保證Chibby的空間構(gòu)象穩(wěn)定，，若為單體，雖具有抑制β-catenin的能力，并保持了自身從胞質(zhì)向胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移的能力，但其轉(zhuǎn)運效率大大降低【11】。另外，甲狀腺癌-1（Thyroid cancer-1，TC-1）通過與Chibby結(jié)合從β-catenin/Chibby復(fù)合體中解離出Chibby，增強(qiáng)β-catenin的活性【13】。圖1：Chibby抑制β-catenin作用機(jī)制的示意圖（圖片來源于【7】）Chibby作為潛在的腫瘤抑制因子

該研究的研究對象均符合入選標(biāo)準(zhǔn)，由實驗者 1 人在臨床收集，并由實驗者 1 人收集病人的相關(guān)臨床資料，嚴(yán)格按照病理回報結(jié)果登記填寫，對研究對象的病理標(biāo)本進(jìn)行編碼至所有結(jié)果出來后破碼，各個實驗均由實驗者本人在同一實驗室、同一實驗儀器及同一批號試劑的條件下完成，實驗過程中合理設(shè)立平行對照以及陽性或陰性對照，病理診斷及結(jié)果判定以兩名訓(xùn)練有素的病理科醫(yī)師觀察結(jié)果為準(zhǔn)。3 結(jié)果3.1Real-time PCR 方法檢測 Chibby mRNA 的表達(dá)結(jié)果3.1.1 熒光定量 PCR 儀檢測結(jié)果圖及意義提取同一患者正常喉粘膜及喉癌組織中的總 RNA，逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，以 18sRNA 作為內(nèi)參，通過 Real time PCR 法檢測 Chibby mRNA 的表達(dá)水平。圖 2 顯示 Real-time PCR 檢測時的擴(kuò)增曲線和溶解曲線。擴(kuò)增曲線圖顯示各樣品的反應(yīng)均已達(dá)到平臺期，溶解曲線顯示 Chibby 與 18sRNA 為單一的峰。提示引物設(shè)計合理，RNA 樣品完整、無降解，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物特異性高，實驗數(shù)據(jù)可信。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R739.65

【參考文獻(xiàn)】

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1 趙巖;吳干勛;胡俊蘭;趙瑞力;葛俊恒;王占龍;;β-連環(huán)蛋白、上皮鈣粘蛋白及Wnt-1在喉癌中的表達(dá)及意義[J];河北醫(yī)藥;2009年07期

2 鄭紅;林波;趙國強(qiáng);董子明;;慢病毒載體的構(gòu)建及低表達(dá)和過表達(dá)CEA EC9706細(xì)胞株的建立[J];河南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2010年03期

3 田秀芬;湯建芬;;β-catenin在喉癌中的表達(dá)及臨床意義[J];臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志;2009年09期

本文編號：2557855