【摘要】：鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）由于與EB病毒感染關(guān)系密切而成為獨(dú)特的頭頸部腫瘤，具有轉(zhuǎn)移早（初診轉(zhuǎn)移率約60%）、易復(fù)發(fā)及5年生存率低下（50%以下）等臨床特點(diǎn)，其中易轉(zhuǎn)移的特性是危害廣大患者生命健康的根本原因之一。然而鼻咽癌的易轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，目前尚不完全清楚，近年來一直是腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。 新癌基因eIF4E（eukaryotic translation initiation factor4E，真核翻譯起始因子4E）作為蛋白質(zhì)翻譯的關(guān)鍵因子，在翻譯起始階段對(duì)眾多癌基因和生長因子的蛋白翻譯起限速作用。eIF4E的異�；罨蛇x擇性啟動(dòng)癌基因mRNA翻譯表達(dá)。已有臨床研究報(bào)道eIF4E在肺癌、乳腺癌、食管癌等多種腫瘤組織中表達(dá)升高，并與這些腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。我們的前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組織中eIF4E高表達(dá)，提示eIF4E與鼻咽癌轉(zhuǎn)移有關(guān)。章俊等在組織標(biāo)本中采用免疫組化的方法初步研究發(fā)現(xiàn)eIF4E在鼻咽癌組織中高表達(dá)，并與LMP1的表達(dá)呈正相關(guān)，與患者5年生存率呈反比。本課題組對(duì)全球718例鼻咽癌的Meta分析證實(shí)LMP1導(dǎo)致鼻咽癌轉(zhuǎn)移。在此基礎(chǔ)上，本課題組在鼻咽癌CNE2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染LMP1表達(dá)質(zhì)粒后，發(fā)現(xiàn)eIF4E基因mRNA表達(dá)水平升高。因此，我們假設(shè)：“eIF4E被LMP1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活化，進(jìn)而促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。”迄今未見相關(guān)研究報(bào)道。相對(duì)于轉(zhuǎn)錄水平，蛋白翻譯水平的調(diào)控對(duì)于腫瘤的發(fā)生發(fā)展更為直接有效。而鼻咽癌的癌蛋白翻譯水平調(diào)控研究目前報(bào)道較少，尤其是源頭癌基因LMP1作為跨膜轉(zhuǎn)化蛋白如何將相關(guān)促癌信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)橐幌盗邪┗虻姆g表達(dá)，進(jìn)而引起鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)行為的改變，亟待更多更深入的研究。因此，本論文將就鼻咽癌細(xì)胞中eIF4E受LMP1轉(zhuǎn)錄活化的機(jī)制，eIF4E轉(zhuǎn)錄活化對(duì)于鼻咽癌增殖侵襲的調(diào)控作用進(jìn)行初步探討，以期為闡明鼻咽癌易轉(zhuǎn)移機(jī)制提供新的研究思路，為臨床監(jiān)控鼻咽癌患者預(yù)后提供新的檢測指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。 【目的】 1.研究eIF4E在鼻咽癌細(xì)胞中高表達(dá)的機(jī)制。 2.研究eIF4E在鼻咽癌細(xì)胞中被LMP1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活化的機(jī)制。 3.研究eIF4E的轉(zhuǎn)錄活化對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響。 【方法】 1.細(xì)胞株：CNE1（高分化鼻咽癌細(xì)胞株，EBV陰性），CNE2（低分化鼻咽癌細(xì)胞株，初建時(shí)EBV陽性），B95-8細(xì)胞（EB病毒感染的永生化絨猴外周血淋巴細(xì)胞株，EBV陽性，LMP1強(qiáng)陽性表達(dá)），以CNE1和CNE2細(xì)胞為研究對(duì)象，B95-8細(xì)胞為對(duì)照。 2.實(shí)驗(yàn)方法 （1）通過基因重組方法構(gòu)建含eIF4E啟動(dòng)子的pGL3Basic-eIF4E重組質(zhì)粒、eIF4E全長表達(dá)重組質(zhì)粒、eIF4E shRNA重組質(zhì)粒，LMP1shRNA重組質(zhì)粒，c-myc-siRNA載體。 （2）利用qPCR實(shí)驗(yàn)檢測鼻咽癌細(xì)胞及B95-8細(xì)胞中eIF4E、LMP1、c-mycmRNA表達(dá)水平。 （3）利用Western Blotting實(shí)驗(yàn)檢測LMP1轉(zhuǎn)染對(duì)鼻咽癌細(xì)胞eIF4E蛋白表達(dá)水平的影響。 （4）利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測eIF4E基因啟動(dòng)子活性。 （5）采用RNAi和慢病毒包裝技術(shù)，構(gòu)建eIF4E干擾慢病毒顆粒，并借助慢病毒感染實(shí)驗(yàn)和穩(wěn)定干擾細(xì)胞篩選實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建穩(wěn)定干擾eIF4E的鼻咽癌細(xì)胞株及對(duì)照細(xì)胞株。 （6）采用CCK8增殖實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)，檢測eIF4E轉(zhuǎn)錄異常對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)和侵襲活性的影響。 【結(jié)果】 1. eIF4E被LMP1顯著誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活化 1.1LMP1轉(zhuǎn)染可促進(jìn)eIF4E mRNA的表達(dá) ①LMP1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CNE1細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)LMP1表達(dá)，eIF4E基因的mRNA表達(dá)水平隨之顯著上調(diào)，是對(duì)照組的1.6倍（P 0.01）。 ②LMP1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CNE2細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)LMP1表達(dá)，eIF4E基因的mRNA表達(dá)水平隨之顯著上調(diào)，是對(duì)照組的3.0倍（P 0.01），且比在CNE1細(xì)胞中的升高幅度大（P 0.01）。 ③LMP1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CNE1細(xì)胞，CNE1/LMP1細(xì)胞有LMP1表達(dá)，eIF4E基因的mRNA水平是對(duì)照組的1.7倍（P 0.01），與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。 ④LMP1表達(dá)質(zhì)粒劑量梯度瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CNE2細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組LMP1mRNA水平呈梯度升高，eIF4E基因mRNA水平也伴隨LMP1表達(dá)質(zhì)粒劑量梯度升高而升高（P 0.01）。 ⑤成功構(gòu)建LMP1干擾質(zhì)粒（LMP1-shRNA），干擾效率達(dá)65.0%以上。 ⑥RNAi技術(shù)干擾B95-8細(xì)胞LMP1表達(dá)，LMP1mRNA表達(dá)水平下調(diào)70.0%，eIF4E的mRNA表達(dá)水平下調(diào)72.0%。 1.2LMP1轉(zhuǎn)染可促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞eIF4E蛋白的表達(dá) ①LMP1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CNE1細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組LMP1蛋白出現(xiàn)表達(dá)，，eIF4E蛋白表達(dá)水平升高，是對(duì)照MOCK和vector組的2.8倍（P 0.01），與轉(zhuǎn)錄水平改變一致。 ②LMP1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CNE2細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組可測得LMP1蛋白表達(dá)，eIF4E蛋白表達(dá)水平升高，是對(duì)照組的4.7倍（P 0.01），與轉(zhuǎn)錄水平改變一致，且比在CNE1細(xì)胞中的升高幅度大（P 0.01）。 ③LMP1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CNE1細(xì)胞，CNE1/LMP1細(xì)胞LMP1蛋白高表達(dá)，而eIF4E蛋白表達(dá)水平是對(duì)照組細(xì)胞的3.0倍（P 0.01），與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。 2. eIF4E在鼻咽癌細(xì)胞中被LMP1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活化的機(jī)制 2.1LMP1轉(zhuǎn)染可促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞eIF4E啟動(dòng)子活性升高 ①成功構(gòu)建含有eIF4E啟動(dòng)子序列的重組報(bào)告基因質(zhì)粒。 ②瞬時(shí)LMP1轉(zhuǎn)染CNE1細(xì)胞，eIF4E啟動(dòng)子活性比對(duì)照組增強(qiáng)20.0倍（P0.01）。 ③瞬時(shí)LMP1轉(zhuǎn)染CNE2細(xì)胞，eIF4E啟動(dòng)子活性比對(duì)照組增強(qiáng)47.0倍（P0.01），比在CNE1細(xì)胞中的增強(qiáng)效果明顯。 2.2在LMP1過表達(dá)狀態(tài)下沉默c-myc可明顯降低eIF4E的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平 ①LMP1在CNE1細(xì)胞的穩(wěn)定表達(dá)使CNE1/LMP1細(xì)胞c-myc和eIF4E基因mRNA水平升高，分別為對(duì)照組的8.2和1.8倍（P 0.01）。 ②干擾LMP1，B95-8細(xì)胞的c-myc和eIF4E基因mRNA水平隨LMP1表達(dá)降低而下調(diào)，分別比對(duì)照組下降54.0%和60.0%（P 0.01）。 ③在LMP1高表達(dá)狀態(tài)下，干擾CNE1細(xì)胞c-myc表達(dá)，c-myc的mRNA表達(dá)下降，隨之eIF4E轉(zhuǎn)錄表達(dá)比對(duì)照組下降35.0%（P 0.05），LMP1mRNA水平亦降低，比對(duì)照組下降30.0%（P 0.05）。 2.3eIF4E過表達(dá)可導(dǎo)致LMP1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平升高 ①成功構(gòu)建含有eIF4E全長序列的GFP融合重組質(zhì)粒pEGFPN1-eIF4E。 ②瞬時(shí)轉(zhuǎn)染eIF4E表達(dá)質(zhì)粒，CNE1細(xì)胞的eIF4E的mRNA水平比對(duì)照組升高18.0倍（P 0.01），LMP1基因表達(dá)比對(duì)照組升高6.0倍（P 0.01）。 3eIF4E被LMP1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活化對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)和侵襲活性的影響 ①成功構(gòu)建eIF4E干擾慢病毒顆粒，干擾效率可達(dá)70.0%以上。 ②成功構(gòu)建穩(wěn)定干擾eIF4E表達(dá)70.0%以上的細(xì)胞模型（CNE2siEp）及其空載體對(duì)照細(xì)胞株（CNE2siNC）。 ③LMP1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CNE1細(xì)胞，細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)和侵襲活性分別比對(duì)照組升高1.1倍、2.5倍和1.4倍（P 0.05）。 ④LMP1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CNE2細(xì)胞，細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)和侵襲活性分別比對(duì)照組升高1.1倍、3.0倍和1.6倍（P 0.05），其中運(yùn)動(dòng)和侵襲活性的改變比在CNE1細(xì)胞中明顯。 ⑤LMP1在CNE1細(xì)胞中的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)，與對(duì)照組相比，細(xì)胞周期出現(xiàn)異常，G1期細(xì)胞比例下降，S期細(xì)胞比例增加（P 0.01）；CNE1/LMP1細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲活性分別比對(duì)照組升高1.7倍和1.6倍（P 0.01）。 ⑥穩(wěn)定干擾eIF4E轉(zhuǎn)錄表達(dá)，CNE2siEp細(xì)胞出現(xiàn)增殖抑制，群體倍增時(shí)間延長，G1期阻滯，靜止期細(xì)胞（G0/G1）比例升高，DNA合成期（S）細(xì)胞比例下降，細(xì)胞增殖活性減弱，運(yùn)動(dòng)和侵襲活性降低，僅為對(duì)照CNE2組的59.0-73.0%（P 0.05）。 ⑦在LMP1高表達(dá)狀態(tài)下，干擾eIF4E后CNE1細(xì)胞比對(duì)照組的增殖活性下降10.0%（P 0.05），運(yùn)動(dòng)活性下降40.0%（P 0.01），侵襲活性降低50.0%（P 0.01）。 ⑧在LMP1高表達(dá)狀態(tài)下，干擾eIF4E后CNE2細(xì)胞比對(duì)照組，增殖活性下降10.0%（P 0.05），運(yùn)動(dòng)活性下降63.0%（P 0.01），侵襲活性降低37.0%（P 0.01）。 【結(jié)論】 1.首次發(fā)現(xiàn)eIF4E在鼻咽癌細(xì)胞中可被LMP1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活化，這可能是eIF4E在鼻咽癌中高表達(dá)的直接原因。eIF4E被LMP1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致eIF4E蛋白水平升高，提示eIF4E的轉(zhuǎn)錄活化在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中具有重要意義。eIF4E被LMP1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄在低分化鼻咽癌細(xì)胞（在臨床上90%鼻咽癌為低分化型，與EBV感染關(guān)系密切）中比在高分化鼻咽癌細(xì)胞（僅占臨床鼻咽癌的5%，與EBV感染無關(guān)）中明顯，提示eIF4E的轉(zhuǎn)錄活化參與EB病毒的致癌效應(yīng)。在絨猴淋巴瘤B95-8細(xì)胞中eIF4E也可被LMP1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，表明eIF4E被LMP1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄在EBV相關(guān)腫瘤中可能普遍存在。 2. eIF4E在鼻咽癌細(xì)胞中被LMP1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活化的可能機(jī)制是：LMP1通過誘導(dǎo)c-myc表達(dá)，c-myc轉(zhuǎn)而結(jié)合eIF4E啟動(dòng)子，激活eIF4E轉(zhuǎn)錄活化。意外的發(fā)現(xiàn)是，轉(zhuǎn)錄表達(dá)eIF4E可提高LMP1mRNA水平，提示eIF4E可誘導(dǎo)LMP1轉(zhuǎn)錄，兩個(gè)基因可能形成LMP1/eIF4E正反饋環(huán)，但eIF4E誘導(dǎo)LMP1表達(dá)的具體機(jī)制不詳，有待進(jìn)一步研究。 3. eIF4E被LMP1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活化后可促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)和侵襲，而且對(duì)低分化鼻咽癌細(xì)胞比高分化鼻咽癌細(xì)胞的影響更明顯，對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲活性比增殖和細(xì)胞周期的作用更明顯。 4. eIF4E可能是LMP1致癌效應(yīng)信號(hào)傳遞的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，是下一步作為深入研究控制鼻咽癌增殖轉(zhuǎn)移的潛在靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

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1 楊靜,鄧錫云,鄧琳,丁琳,顧煥華,易薇,曹亞;EBV LMP1通過誘導(dǎo)c-myc表達(dá)活化端粒酶hTERT[J];病毒學(xué)報(bào);2003年03期

2 王雯s

本文編號(hào)：2538219