【摘要】：長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)可以通過許多種機(jī)制來發(fā)揮它的生物學(xué)功能,這些機(jī)制主要包括基因印記和染色質(zhì)的重塑、調(diào)控細(xì)胞的周期和調(diào)控基因的剪接以及調(diào)控mRNA降解和mRNA的翻譯等。IncRNA通過這些作用機(jī)制在不同水平進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新型的長(zhǎng)鏈非編碼RNA基因,我們暫時(shí)命名為Z38。已證實(shí)LncRNAZ38基因高表達(dá)于腫瘤組織,低表達(dá)于癌旁組織。本研究的目的在于探討穩(wěn)定干擾LncRNAZ38基因的表達(dá)對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、5-8F功能和機(jī)制的影響。主要在細(xì)胞水平和分子水平上進(jìn)行研究。具體開展了以下工作:(1)采用包埋shRNA-Z38的慢病毒轉(zhuǎn)染進(jìn)人鼻咽癌細(xì)胞HNE1與5-8F中,經(jīng)嘌呤霉素篩選,獲得穩(wěn)定干擾的鼻咽癌細(xì)胞系。(2)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法在鼻咽癌細(xì)胞HNE1與5-8F中檢測(cè)LncRNA Z38的表達(dá)水平。(3)使用MTT、平板克隆集落形成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾LncRNA Z38表達(dá)后鼻咽癌細(xì)胞HNE1、5-8F的增殖能力和細(xì)胞遷移能力的變化。(4)采用蛋白質(zhì)印跡(Western blot)的方法檢測(cè)干擾LncRNA Z38表達(dá)后鼻咽癌細(xì)胞HNE1、5-8F中抑癌因子p53、p21表達(dá)水平的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)干擾鼻咽癌細(xì)胞后,顯著降低了 LncRNA Z38基因的表達(dá)水平,干擾LncRNA Z38基因在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)。后通過一系列腫瘤細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn),在細(xì)胞水平上證實(shí)了干擾LncRNAZ38的表達(dá)后,鼻咽癌細(xì)胞的增殖能力、集落形成能力降低,穿過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)降低。后通過蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)到干擾LncRNAZ38的表達(dá)后,鼻咽癌細(xì)胞中抑癌因子p53、p21表達(dá)量上調(diào)。此結(jié)果與我們的假設(shè)一致,Z38基因是癌癥相關(guān)基因之一。
【圖文】：

這種方法在肝癌和鼻咽癌以及骨肉瘤等多種類型腫瘤研究中應(yīng)用越來越來普遍。逡逑本實(shí)驗(yàn)在ｐＧＭＬＶ－ＳＣ５－ｅＧＦＰ載體上建立靶向目的基因ＬｃｎＲＮＡ邋Ｚ３８的慢病毒干擾逡逑載體，其載體示意圖如下圖２．１，慢病毒載體上表達(dá)有ｅＧＦＰ基因，能夠表達(dá)熒光蛋白，逡逑并且載體上還攜帶有嘌呤霉素的抗性基因，能夠在轉(zhuǎn)染后利用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染逡逑的細(xì)胞。逡逑基于目的基因ＬｎｃＲＮＡ邋Ｚ３８的基因序列，根據(jù)設(shè)計(jì)干擾ＲＮＡ表達(dá)序列原理，選取逡逑了最為合適的動(dòng)力學(xué)參數(shù)靶點(diǎn)為５’－ＧＣＡＴＣＴＧＧＧＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＴＡ－３’，設(shè)計(jì)出干擾逡逑ＬｎｃＲＮＡ邋Ｚ３８邋表達(dá)的千擾序列為邋Ｆ：邋５’－ＧＣＡＴＣＴＧＧＧＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＴＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡ逡逑ＴＡＡＴＧＡＡＴＴＣ邋ＡＴＣＣＣ邋ＡＧＡＴＧＣＴＴＴＴＴＴ－３邋’，Ｒ邋：邋５５邋－邋Ａ邋ＡＡＡＡＡＧＣ邋ＡＴＣＴＧＧＧ邋ＡＴＧ邋ＡＡＴ逡逑ＴＣＡＴＴＡＴＣＴＣＴＴＧＡＡＴＡＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＣＣＣＡＧＡＴＧＣ－３，。將此干擾邋ＬｎｃＲＮＡ邋Ｚ３８邋的逡逑序列導(dǎo)入慢病毒的載體上進(jìn)行后續(xù)的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。逡逑ｃｐＰＴ／ＣＴＳ逡逑｜邋ｅＧＦＰ逡逑‘邐ｐＧＭＬＶ－ＳＣ５邐—逡逑Ｍ邐ｍＰＧＫ逡逑Ａｍｐ＋邋ＴＯ邐’逡逑ｌ邋Ａ逡逑３，邋ＬＴＲ逡逑圖２．１慢病毒載體圖示逡逑１２逡逑

（４）反應(yīng)結(jié)束后，導(dǎo)出反應(yīng)結(jié)果，計(jì)算目的基因和參照基因ｃｔ、Ａｃｔ和ｒＡＡｅｔ方法：Ｃｔ值由Ｂｉｏ－Ｒａｄ邋ＣＦＸ邋Ｍａｎａｇｅｒ軟件計(jì)算給出；ＡＣｔｌ＝實(shí)驗(yàn)組目的基因Ｃｔ－實(shí)內(nèi)參基因Ｃｔ；邋ＡＣｔ２＝陰性對(duì)照組目的基因Ｃｔ－陰性對(duì)照組內(nèi)參基因Ｃｔ；邋ＡＡＣｔ＝ＡＣｔＱ２；邋２＿ＡＡＱ通過公式計(jì)算得出。結(jié)果分析利用ＧｒａｐｈＲＡＤｐｒｉＳｍ５作出柱狀圖和散點(diǎn)析Ｚ３８基因在細(xì)胞的２＿ＡＣｔ值。逡逑．４實(shí)驗(yàn)結(jié)果逡逑．４．１倒置顯微鏡下檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率逡逑慢病毒載體介導(dǎo)ｓ＿Ａ轉(zhuǎn)染進(jìn)人鼻咽癌細(xì)胞ＨＮＥ１和５－８Ｆ后，由于慢病毒載帶嘌呤霉素抗性基因及表達(dá)綠色熒光蛋白的基因，因此通過嘌呤霉素對(duì)細(xì)胞經(jīng)行后，在倒置熒光顯微鏡下比較同一視野的細(xì)胞熒光照片和明場(chǎng)照片可以反映慢病體轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞的效率，即ｓｈＲＮＡＺ３８轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞的效率。結(jié)果顯示，以Ｍ０Ｉ邋（感數(shù)）＝５０感染細(xì)胞細(xì)胞后，且通過嘌呤霉素濃度為３邋ｕｇ／ｍｌ的培養(yǎng)基篩選一周后細(xì)光蛋白表達(dá)率接近９０％，如圖２．２所示，此時(shí)感染效率較為適宜，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2532227