【摘要】：增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(Proliferative vitreoretinopathy,PVR)是嚴重的致盲性眼病之一,臨床上復(fù)雜難治。雖然近年來隨著手術(shù)技巧和設(shè)備的改進提高了視網(wǎng)膜脫離復(fù)位手術(shù)的成功率,但反復(fù)增殖并非少見,仍是視網(wǎng)膜脫離復(fù)位術(shù)失敗的首要原因。藥物防治PVR具有重要意義。目前藥物防治已經(jīng)成為PVR研究的熱點。但由于血-眼屏障的阻擋,眼表和全身用藥難以在玻璃體腔中達到有效的治療濃度。實驗及臨床中已經(jīng)采用玻璃體腔注藥的方式將高濃度藥物靶向輸送至眼內(nèi)組織治療玻璃體視網(wǎng)膜病變。然而因藥物半衰期所限,往往需要多次玻璃體腔注藥以達到持續(xù)的眼內(nèi)藥物治療濃度。但反復(fù)多次的玻璃體腔注射也會產(chǎn)生諸多弊端：一方面會給患者造成操作的不適和情緒及經(jīng)濟負擔,同時需要患者很好的依從性；另一方面可能產(chǎn)生晶狀體損傷、玻璃體積血、視網(wǎng)膜脫離、眼內(nèi)炎等嚴重損害視功能的并發(fā)癥。姜黃素是自傳統(tǒng)中藥姜黃中提取的酚類疏水性化合物,具有廣泛的健康功能和藥理活性,已有多項研究證實姜黃素具有抗纖維化、抗腫瘤、抗炎癥、抗菌、抗氧化及低毒性等多種藥理活性。姜黃素對于PVR等增生性疾病具有廣闊的應(yīng)用前景。但是由于姜黃素為疏水性化合物,組織吸收率低,藥物代謝率快及系統(tǒng)排出迅速,因而限制了姜黃素在臨床上的應(yīng)用。為增加姜黃素的生物利用度并減少玻璃體腔注藥所可能引起的并發(fā)癥,本課題將首先制備載有姜黃素的生物可降解鞏膜塞并對其體外藥物動力學進行初步研究,進而將制備成的載有不同劑量姜黃素的生物可降解鞏膜塞嵌置在兔眼鞏膜壁睫狀體平坦部對其與周圍組織的生物相容性及毒副作用及玻璃體內(nèi)的藥物動力學進行研究,最后通過玻璃體腔注射自血制作PVR兔眼模型,觀察鞏膜睫狀體平坦部置人載有姜黃素的生物可降解鞏膜塞對兔眼PVR模型的防治效果,從而全面評價其防治PVR的可行性問題,探討應(yīng)用姜黃素防治PVR更佳的給藥方式。第一部分 制備載有姜黃素的生物可降解鞏膜塞及其體外動力學研究目的 制備一種可以嵌置在睫狀體扁平部鞏膜壁上,可以緩慢釋放姜黃素至玻璃體腔的生物可降解鞏膜塞形的藥物釋放系統(tǒng)并對其體外藥物動力學作一初步研究。方法 應(yīng)用Octagon 200振動篩粉器將聚乳酸聚乙醇酸共聚物(polylactide-co-glycolide,PLGA姜黃素制成100um大小顆粒,將不同劑量的姜黃素與PLGA按1：5均勻混合后置于鞏膜塞模具中壓制成鞏膜塞。再將模具連同其內(nèi)的鞏膜塞置于烤箱中,燒結(jié)溫度設(shè)置在55℃范圍,持續(xù)30分鐘。將制備好的載有不同劑量姜黃素的鞏膜塞置人裝有1.5ml平衡鹽溶液的玻璃試管內(nèi),37℃溫浴,每24小時收集BSS姜黃素洗脫液。試管中則加入新鮮BSS 1.5ml,如此循環(huán)重復(fù)14天。應(yīng)用高效液相色譜技術(shù)(HPLC)檢測各時間點BSS洗脫液內(nèi)姜黃素藥物質(zhì)量濃度。結(jié)果：制備成分別含有0.5mg、1.0mg、1.5mg三種劑量姜黃素的生物可降解鞏膜塞,直徑約lmm,長約5mm。體外動力學結(jié)果顯示以PLGA為載體物質(zhì)的姜黃素生物可降解鞏膜塞可持續(xù)釋放姜黃素,含有三種姜黃素劑量的鞏膜塞均在第一個24小時測試點釋放量最大,達濃度峰值,第二個24小時后釋放量降低并呈相對穩(wěn)定的速度緩慢釋放。BSS洗脫液中姜黃素質(zhì)量濃度結(jié)果顯示含有1.5mg姜黃素的鞏膜塞持續(xù)14天均高于15ug/ml,1.0mg姜黃素的鞏膜塞持續(xù)12天高于15ug/ml,其余兩天略低于15ug/ml,含有0.5mg姜黃素的鞏膜塞持續(xù)14天低于15ug/ml。結(jié)論：可以應(yīng)用PLGA作為載體物質(zhì)與不同劑量的姜黃素混合制備生物可降解的鞏膜塞形藥物釋放系統(tǒng),體外動力學檢測其可穩(wěn)定釋放一定量的姜黃素14天,其中含有1.5mg、1.0mg姜黃素的生物可降解鞏膜塞在BSS液中的質(zhì)量濃度可在一定的時間內(nèi)持續(xù)高于15ug/ml。第二部分載有姜黃素的生物可降解鞏膜塞的眼部組織相容性及毒性研究目的：對載有姜黃素的生物可降解鞏膜塞置人鞏膜壁后其對周邊眼部組織生物相容性及毒性問題進行研究以期對這種給藥方式在眼部應(yīng)用的安全性問題進行評價。方法：共44只實驗用兔,其中32只實驗用兔隨機分為對照組,0.5mg組,1.0mg組及1.5mg組4組,每組8只。對照組為選取每只兔的右眼只做鞏膜穿刺而不植入鞏膜塞。其余三組則選取每只兔的右眼結(jié)膜下鞏膜壁嵌置載有不同劑量姜黃素的鞏膜塞。其余12只兔隨機分成上述4組,每組3只,雙眼使用方法同上(本組供14d、28d、60d時摘取眼球使用)。分別于鞏膜壁嵌置鞏膜塞后1、7、14、21、28d測量各實驗眼眼壓、應(yīng)用裂隙燈觀察結(jié)膜反應(yīng)、前房炎癥反應(yīng)以及角膜透明性,間接檢驗鏡觀察玻璃體視網(wǎng)膜情況,并在各檢查點對實驗眼進行暗適應(yīng)ERG檢查。對在14d、28d、60d摘取的眼球行光鏡及電鏡組織學檢查。結(jié)果：鞏膜塞植入后各檢查時間點,對照組與各劑量鞏膜塞組實驗眼眼壓各組間差異無統(tǒng)計學意義。實驗后1d、7d各實驗組均有不同數(shù)量的實驗眼出現(xiàn)程度不同的結(jié)膜反應(yīng),但各組間差異無統(tǒng)計學意義(F=0.301, P=0.824;F=0.333,P=0.801),其余各實驗檢查點無結(jié)膜炎癥反應(yīng),實驗整個過程,未發(fā)現(xiàn)鞏膜穿刺口滲漏,各實驗眼角膜透明,無前房反應(yīng),也未見玻璃體積血、視網(wǎng)膜脫離等并發(fā)癥。ERG檢查各組各時間點,實驗組眼a波和b波振幅與對照組眼相比差異無統(tǒng)計學意義。各時間點視網(wǎng)膜組織學檢查未見異常改變。結(jié)論：應(yīng)用PLGA作為藥物載體的姜黃素生物可降解鞏膜塞植入鞏膜穿刺口,鞏膜塞與穿刺口間密閉性好,無滲漏,無炎癥反應(yīng),對周邊組織無損傷,經(jīng)過1至2個月鞏膜塞自然降解,無需二次手術(shù)取出,可以作為姜黃素治療PVR的新型給藥裝置。為更好的發(fā)揮姜黃素各種藥理活性提供了新的給藥形式。第三部分載有姜黃素的生物可降解鞏膜塞在兔眼玻璃體腔內(nèi)的藥物動力學研究目的：探討載有姜黃素的生物可降解鞏膜塞置人眼內(nèi)后玻璃體內(nèi)的藥物釋放特點,為臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。方法：將22只新西蘭白兔隨機分為標準組及質(zhì)控組各3只兔(6只眼)和實驗組16只兔。實驗組再隨機分為2組,分別為1.0mg、1.5mg組,每組8只兔。標準及質(zhì)控組動物不行鞏膜壁鞏膜塞置人操作,只行玻璃體抽取,實驗組右眼于角膜緣后3mm鞏膜壁嵌入載有姜黃素的生物可降解鞏膜塞,分別于鞏膜壁置人鞏膜塞后Id、7d、14d、21d、28d抽取并制備玻璃體待檢樣品。應(yīng)用高效液相色譜技術(shù)(HPLC)檢測玻璃體腔內(nèi)藥物質(zhì)量濃度。結(jié)果：姜黃素與玻璃體內(nèi)源性物質(zhì)之間的色譜峰分離良好,姜黃素保留時間為4.3 min。提取回收率約90%,日內(nèi)、日間變異較小。玻璃體內(nèi)姜黃素質(zhì)量濃度在2-128 μg/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,標準曲線為y=32572x+46109(r=0.999)。所有植入載有姜黃素的生物可降解鞏膜塞的實驗眼玻璃體內(nèi)持續(xù)4周均檢測到不同濃度的姜黃素。1.5mg、1.0mg兩種劑量的鞏膜塞組均在7d時間檢測到玻璃體內(nèi)姜黃素濃度達到峰值濃度,分別為45.71土5.61和24.18±2.14(μg/mL);28d所測得的玻璃體內(nèi)姜黃素濃度最低,分別為9.51土1.03和7.23±0.83(μig/mL)。1.5mg、1.0mg組玻璃體內(nèi)姜黃素濃度分別持續(xù)21d、14d維持在15ug/ml之上。結(jié)論：載有姜黃素的生物可降解鞏膜塞嵌置在鞏膜壁后可以持續(xù)釋放姜黃素至玻璃體腔持續(xù)至少4周以上,藥物濃度可持續(xù)穩(wěn)定在姜黃素抑制RPE細胞增殖的最佳有效濃度15ug/ml以上,可以作為姜黃素抑制PVR的新型給藥方法。第四部分兔眼增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變模型的建立及相關(guān)因子的測定目的：在藥物防治PVR的研究過程中,選擇一種操作簡單、節(jié)約成本、成模率高的制作PVR模型的方法并應(yīng)用抗體芯片方法檢測實驗眼玻璃體樣本中相關(guān)因子的表達。方法：新西蘭白兔16只,隨機分為對照組和模型組,每組8只,右眼為實驗眼。所有實驗兔眼在角膜緣后3mm處用鞏膜穿刺刀刺向玻璃體中心部,勿傷及晶狀體及周邊視網(wǎng)膜,用穿刺刀向兩側(cè)擴大切口,切口與角膜緣平行達4mm,用8-0可吸收線間斷縫合切口后以2ml注射器從穿刺口進針抽取0.2ml玻璃體。對照組注入0.2mlBSS液,模型組注入0.2ml自血。術(shù)后1、3、7、14、21和28d進行裂隙燈顯微鏡、間接眼底鏡等眼科檢查;眼科B超檢查玻璃體和視網(wǎng)膜情況。眼后節(jié)PVR分級采用Fastenberg分級方法：0級：眼底正常,視網(wǎng)膜在位,玻璃體無混濁無增殖膜;1級：玻璃體混濁并可見增殖膜;2級：局灶性牽拉,局限性血管改變,充血擴張等,3級：髓線處的局限性網(wǎng)脫以及視網(wǎng)膜皺褶;4級：廣泛的視網(wǎng)膜脫離,全部髓線脫離,視盤周圍視網(wǎng)膜脫離;5級：視網(wǎng)膜全脫離、對折以及裂孔形成。分別于操作后Id、7d、14d、21d、28d采取玻璃體樣本,應(yīng)用QAL-CYT-2芯片檢測各檢測點抽取的玻璃體樣本中IL-1α、IL-1β、IL-8、IL-17、IL-21、MMP-9、leptin, MIP-1β、NCAM-1、 TNF-α等細胞因子的表達。結(jié)果：對照組術(shù)后各時間點無PVR發(fā)生。模型組術(shù)后PVR分級7d時5只眼0級(只存在玻璃體混濁未見增生膜同時存在)、3只眼1級;14d時1只眼0級、5只眼1級,1只眼2級、1只眼3級;21d時2只眼2級、5只眼3級、只眼4級;28d時2只眼3級、4只眼4級、2只眼5級。實驗后各檢測點模型組玻璃體中IL-1α,IL-1β、IL-8、Leptin、MMP-9、NCAM-1、TNF-α的表達均高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),IL-1α、IL-1β、IL-8、TNF-α, MMP-9隨時間進展表達量逐漸增高,至14-21d達到峰值。在各時間點對照組實驗眼玻璃體中未檢測到IL-17、IL-21的表達,在14d、21d檢測點模型組玻璃體中IL-17的表達分別為1.2±0.50pg/ml、9.2±3.9pg/ml,7d、14d模型組玻璃體中IL-21的表達分別為6.0±2.3、9.8±3.0pg/ml。其余時間點實驗眼未檢測到IL-17、IL-21的表達。各時間點模型組熒光掃描圖顯示熒光亮度或面積均高于或大于對照組。實驗后各檢測點模型組與對照組均未檢測到MIP-1β的表達。結(jié)論:兔眼距角鞏膜緣3mm處鞏膜穿刺抽取玻璃體聯(lián)合玻璃體腔注射自血建立PVR模型的方法操作簡單,成模時間快,成模率高,可檢測到多種炎癥因子表達,可作為藥物防治PVR研究的實驗?zāi)Ｐ汀５谖宀糠州d有姜黃素的生物可降解鞏膜塞對兔增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變及相關(guān)因子的抑制作用研究目的：探討載有姜黃素的生物可降解鞏膜塞置人鞏膜壁后對自血玻璃體腔注射制作的PVR病變程度及相關(guān)因子的抑制作用。方法：選用新西蘭白兔30只,隨機分為模型組與治療組,每組各15只,右眼為實驗眼。模型組：玻璃體腔注射自血;治療組：玻璃體腔注射自血+鞏膜壁嵌置載有1.5mg姜黃素生物可降解鞏膜塞。術(shù)后Id、3d、7d, 14d、21d和28d使用裂隙燈顯微鏡觀察角膜、房水、晶狀體、前節(jié)炎癥反應(yīng)情況;使用間接檢眼鏡和B超檢查玻璃體視網(wǎng)膜情況。PVR分級采用FastenbergPVR分級方法分級。分別于鞏膜壁嵌置鞏膜塞后1d、7d、14d、 21d、28d采取玻璃體樣本,應(yīng)用QAL-CYT-2芯片檢測各檢測點采取的玻璃體樣本中IL-1α、IL-1β、IL-8、IL-17、IL-2、MMP-9、leptin、MIP-1β NCAM-1、TNF-α等細胞因子的表達。結(jié)果：各檢測時間點治療組PVR的發(fā)展程度及分級均低于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);抗體芯片技術(shù)檢測結(jié)果,各檢測時間點治療組IL-1α、IL-1β、IL-8、MMP-9、TNF、NCAM-1、leptin的表達均低于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。IL-17因子在14d時模型組為1.2±0.5pg/ml,21d時模型組、治療組玻璃體中的表達分別為9.2±3.0pg/ml、6.2±2.1pg/ml,差異有統(tǒng)計學意義(t=3.148,P=0.004),其余測試點模型組與治療組未檢測到該因子的表達;7d、14d模型組、治療組玻璃體中IL-21的表達分別為6.0±2.2、3.8±1.3 pg/ml; 10.0±3.0、6.8±1.9pg/ml,組間有顯著性差異(t=3.169,P=0.004; t=3.490,P=0.002),其余檢測點未檢測到該因子的表達,各時間點模型組、治療組均未檢測到MIP-1∞的表達。治療組熒光掃描圖顯示熒光亮度或面積均低于或小于模型組。結(jié)論：載有1.5mg姜黃素的生物可降解鞏膜塞置入自血玻璃體腔注射的實驗眼鞏膜壁后,可以通過抑制IL-1、IL-8、TNF、MMP-9等細胞因子的表達實現(xiàn)對兔眼PVR病變的抑制作用�；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果可以得出以下結(jié)論：應(yīng)用PLGA作為載體物質(zhì)制備載有姜黃素的生物可降解鞏膜塞,HPLC檢測體外及體內(nèi)藥物釋放量可穩(wěn)定釋放姜黃素保持一定濃度至少14天;鞏膜塞置入兔眼鞏膜壁后,組織相容性好,對視網(wǎng)膜無毒性,經(jīng)過4-8周鞏膜塞自然降解,無明顯炎癥、感染、滲漏發(fā)生并可有效抑制自血玻璃體腔注射所引發(fā)的PVR的發(fā)生、發(fā)展。因此這種生物可降解鞏膜塞可作為姜黃素眼部應(yīng)用的新的給藥方式。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R774.1
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本文編號：
2532171
