【摘要】：視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa,RP)疾病目前在全球范圍內(nèi)患者數(shù)量呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢,它是一種因感光細(xì)胞變性而最終導(dǎo)致患者視覺障礙甚至視覺喪失的疾病。在過去的幾十年間,人們對視網(wǎng)膜變性疾病的發(fā)生發(fā)展及發(fā)病機(jī)制、臨床治療等方面的研究都有了很大的進(jìn)展,但尚未發(fā)現(xiàn)有效治療手段。近年來,隨著光遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展,人們期望由此為該疾病,特別是視網(wǎng)膜色素變性晚期病人找到復(fù)明的途徑。所謂光遺傳學(xué)技術(shù),是指利用遺傳學(xué)技術(shù)使目的細(xì)胞表達(dá)光敏感蛋白(能夠被光激活的一大類膜蛋白),可實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞的光學(xué)控制,這種結(jié)合光學(xué)和遺傳學(xué)的方法稱為光刺激基因工程或光遺傳學(xué)。該新興技術(shù)的關(guān)鍵是:研究者向?qū)嶒?yàn)動物靶器官內(nèi)注射一種光敏感基因,這種基因能夠?qū)Σ煌ㄩL的光刺激出現(xiàn)對光反應(yīng)。利用光遺傳學(xué)技術(shù)控制轉(zhuǎn)染光基因的細(xì)胞活動具有無損傷、可定量重復(fù)、時空分辨率高、可個性化操作、使用簡單等優(yōu)勢,目前常用的光控離子通道型光敏感蛋白有視紫紅質(zhì)通道蛋白2(channelrhodopsin-2,chr2)和嗜鹽菌紫質(zhì)(halorhodopsin,NpHR)。以往有研究表明,在大鼠視網(wǎng)膜色素變性模型中,將Ch R2和(或)Np HR轉(zhuǎn)染在視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元(神經(jīng)節(jié)細(xì)胞或雙極細(xì)胞)上能夠產(chǎn)生皮層可記錄的視覺誘發(fā)電位,因此被認(rèn)為可以挽救視網(wǎng)膜色素變性大鼠的視功能。但這兩種光敏感蛋白一種(chr2)來源于綠藻,而另一種(NpHR)則是嗜鹽堿單胞菌屬,它們相對于高等哺乳動物來說是異種來源,如果用于未來臨床治療,可能會引起免疫反應(yīng)及倫理學(xué)問題。那么有沒有一種光敏感蛋白本身就存在于高等哺乳類動物體內(nèi)呢?人們發(fā)現(xiàn)在哺乳類動物及人類的視網(wǎng)膜中存在一種視色素melanopsin,它可以接受光刺激并產(chǎn)生對光反應(yīng),它也被認(rèn)為是一種光敏感蛋白,但不屬于光控離子通道型蛋白,而是一種光控G蛋白偶聯(lián)受體蛋白,即光信號激活G蛋白經(jīng)第二信使發(fā)揮作用,當(dāng)給予光刺激后,可引起melanopsin蛋白分子構(gòu)象產(chǎn)生相應(yīng)變化,進(jìn)而產(chǎn)生較慢速度的去極化動作電位來參與到整個視網(wǎng)膜電活動中。近年來有研究使用了視網(wǎng)膜變性的rd1小鼠(retinal degeneration)模型,它是由于磷酸二酯酶β亞基(Pde6b,PDEβ)基因突變而引起感光細(xì)胞(photoreceptor cell)凋亡,在出生后28天感光細(xì)胞層即基本消失,當(dāng)使用光遺傳學(xué)技術(shù)使小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞過表達(dá)鼠來源melanopsin光敏感蛋白后,可以替代凋亡的感光細(xì)胞并明顯改善視網(wǎng)膜變性小鼠的行為學(xué)。與rd1小鼠這一快速視網(wǎng)膜感光細(xì)胞變性模型相比,rcs大鼠(royalcollegeofsurgeonrat,皇家外科學(xué)院大鼠)因患有一種常染色體隱性遺傳病,導(dǎo)致色素上皮(retinalpigmentepithelium,rpe)細(xì)胞吞噬感光細(xì)胞外節(jié)膜盤能力的缺陷,變性進(jìn)展到較晚期時,感光細(xì)胞出現(xiàn)變性死亡,最終致視覺障礙,它是一種經(jīng)典的慢性視網(wǎng)膜感光細(xì)胞變性動物模型,更符合臨床視網(wǎng)膜色素變性疾病的發(fā)生發(fā)展過程。那么,我們使用同樣的光遺傳學(xué)技術(shù)是否也可以挽救慢性視網(wǎng)膜感光細(xì)胞變性鼠的視功能呢,這是我們需要探索與解決的問題。此外,melanopsin雖然在嚙齒類及人類的視網(wǎng)膜內(nèi)都存在,但以往的光遺傳學(xué)技術(shù)使用的melanopsin光敏感蛋白多為嚙齒類動物來源,如果應(yīng)用于臨床治療,必須研究同源同種人來源melanopsin光敏感蛋白是否具有同樣的視覺功能挽救作用。因此在本課題中我們假設(shè):攜帶人來源的melanopsin光敏感蛋白腺相關(guān)病毒能夠轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)細(xì)胞、挽救視網(wǎng)膜變性嚙齒類動物的視功能,適用于視網(wǎng)膜色素變性晚期光遺傳學(xué)治療。本課題采用急性視網(wǎng)膜感光細(xì)胞變性模型(rd1小鼠)和慢性視網(wǎng)膜感光細(xì)胞變性模型(rcs大鼠),研究利用光遺傳學(xué)技術(shù)合成鼠來源及人來源melanopsin光敏感蛋白挽救視網(wǎng)膜變性嚙齒類動物的視功能。本實(shí)驗(yàn)研究方法如下:1、采用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建鼠來源melanopsin腺病毒載體及人來源melanopsin腺相關(guān)病毒載體。2、使用免疫組化及wb蛋白水平檢測方法觀察rcs大鼠在視網(wǎng)膜變性過程中melanopsin光敏感蛋白的表達(dá)變化;采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄,特定光譜刺激后轉(zhuǎn)染細(xì)胞的電反應(yīng)。并在鼠來源melanopsin光基因遺傳學(xué)技術(shù)轉(zhuǎn)染(視網(wǎng)膜下腔轉(zhuǎn)染)后3周、5周、7周行全視網(wǎng)膜電圖(fergflashelectroretinogram)及行為學(xué)openfield實(shí)驗(yàn),研究鼠來源melanopsin光基因蛋白能否挽救rcs大鼠的視功能。3、構(gòu)建人來源melanopsin腺相關(guān)病毒,通過免疫組化染色視網(wǎng)膜鋪片觀察病毒轉(zhuǎn)染效率,以比較玻璃體腔與視網(wǎng)膜下腔轉(zhuǎn)染方法的優(yōu)劣;以及采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄,特定光譜刺激后轉(zhuǎn)染神經(jīng)的電反應(yīng)。4、人來源melanopsin腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染rd1小鼠視網(wǎng)膜后30天、45天行閃光視覺誘發(fā)電位(fvep)檢測及行為學(xué)openfield和條柵視動追隨視敏度檢測,研究利用光遺傳學(xué)技術(shù)是否能夠挽救視網(wǎng)膜快速變性rd1小鼠的視功能。5、人來源melanopsin光基因遺傳學(xué)技術(shù)轉(zhuǎn)染(玻璃體腔/視網(wǎng)膜下腔轉(zhuǎn)染)rcs大鼠后30天、45天、60天行全視網(wǎng)膜電圖(ferg)/閃光視覺誘發(fā)電位(fvep)檢測及行為學(xué)openfield和條柵視動追隨視敏度檢測,研究利用光遺傳學(xué)技術(shù)是否能夠挽救rcs大鼠變性晚期的視功能,并比較兩種轉(zhuǎn)染方式的有效性。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1、成功構(gòu)建鼠來源melanopsin腺病毒載體并驗(yàn)證其體外及體內(nèi)轉(zhuǎn)染力均較好,膜片鉗全細(xì)胞記錄可以記錄到轉(zhuǎn)染293細(xì)胞對480nm藍(lán)光的對光反應(yīng)。rcs大鼠視網(wǎng)膜下腔轉(zhuǎn)染鼠來源melanopsin腺病毒后可以明顯改善其變性晚期全視網(wǎng)膜電圖ferg-b波幅值,且openfield行為學(xué)中轉(zhuǎn)染組大鼠暗室時間明顯增長。表明melanopsin光敏蛋白可以延緩rcs大鼠視網(wǎng)膜變性進(jìn)程。2、成功構(gòu)建人來源melanopsin腺相關(guān)病毒載體,膜片鉗全細(xì)胞記錄可以記錄到在體視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞對420nm藍(lán)光的對光反應(yīng)。并通過玻璃體腔及視網(wǎng)膜下腔轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染rd1小鼠及rcs大鼠視網(wǎng)膜,比較在體轉(zhuǎn)染率后發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜下腔轉(zhuǎn)染方法陽性轉(zhuǎn)染區(qū)域面積更大,視網(wǎng)膜內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染類型更為豐富,確定視網(wǎng)膜下腔轉(zhuǎn)染的優(yōu)勢。3、rd1小鼠在出生后28天視網(wǎng)膜感光細(xì)胞基本全部死亡;當(dāng)利用光遺傳技術(shù)在小鼠變性晚期(生后30天)視網(wǎng)膜下腔轉(zhuǎn)染人來源melanopsin腺病毒后可以使視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞均表達(dá)外源性人來源melanopsin光敏感蛋白,并且可以改善其視覺誘發(fā)電位(fvep)p1波幅值,openfield行為學(xué)中轉(zhuǎn)染組rd1小鼠的暗室時間也明顯增長。表明rd1小鼠視網(wǎng)膜下腔轉(zhuǎn)染人來源melanopsin光基因可以挽救視功能。4、rcs大鼠在出生后60天ferg-b波波形基本呈熄滅性,當(dāng)利用光遺傳學(xué)技術(shù)在rcs大鼠變性中期(生后40天)轉(zhuǎn)染人來源melanopsin后,可以成功使視網(wǎng)膜內(nèi)殘留神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)外源性人來源melanopsin光敏感蛋白,并且可以使變性晚期的rcs大鼠ferg-b波及fvep-p1波幅值出現(xiàn)明顯增高,且波形恢復(fù)可維持至轉(zhuǎn)染后60天,即大鼠天齡100天。在openfield行為學(xué)檢測中光遺傳基因轉(zhuǎn)染組大鼠暗室時間明顯增長,條柵視動追隨行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中其視敏度也有明顯提高。且視網(wǎng)膜下腔轉(zhuǎn)染方法改善效果較玻璃體腔轉(zhuǎn)染更為明顯。表明rcs大鼠玻璃體腔和視網(wǎng)膜下腔轉(zhuǎn)染人來源melanopsin光基因可以延緩變性、挽救視功能。由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出以下結(jié)論1.研究了腺病毒和腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染的效率,首次成功構(gòu)建了人來源melanopsin腺相關(guān)病毒載體;2.率先研究了小鼠和大鼠玻璃體腔和視網(wǎng)膜下不同轉(zhuǎn)染方式對轉(zhuǎn)染率和轉(zhuǎn)染細(xì)胞類型以及功能改善的影響,確定了視網(wǎng)膜下腔轉(zhuǎn)染的優(yōu)勢;3.發(fā)現(xiàn)鼠來源melanopsin光基因遺傳學(xué)技術(shù)可以延緩RCS大鼠視網(wǎng)膜變性進(jìn)程,可能由于腺病毒攜帶的基因表達(dá)不夠穩(wěn)定致有效期不長;4.率先發(fā)現(xiàn)人來源melanopsin光遺傳基因技術(shù),通過視網(wǎng)膜下腔干預(yù)方式可部分改善快速視網(wǎng)膜感光細(xì)胞變性rd1小鼠的視功能,但功能維持時間較短;5.首次報道人來源melanopsin光遺傳基因技術(shù)可以成功挽救慢性視網(wǎng)膜感光細(xì)胞變性大鼠的視功能,延緩病變發(fā)展。結(jié)果顯示光遺傳學(xué)技術(shù)更適用于慢性變性動物模型,而且變性中期干預(yù)的視覺挽救效果更佳。這為視網(wǎng)膜色素變性晚期治療提供了新的手段。
【圖文】：

1 A 圖為 293 細(xì)胞傳代培養(yǎng) 1 天后觀察，均勻散布在培養(yǎng)皿底部，形狀為近三角形，胞體明顯；B 傳代培養(yǎng) 3 天后細(xì)胞狀態(tài)良好，密度佳；C 圖為轉(zhuǎn)染病毒前 293 細(xì)胞狀態(tài)；D 為轉(zhuǎn)來源 melanopsin 腺病毒后 8 小時 293 細(xì)胞熒光表達(dá)情況。2.2.2.2 原代神經(jīng)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)染鼠來源 melanopsin 后的熒光表達(dá)及細(xì)胞鑒定大鼠視網(wǎng)膜原代神經(jīng)節(jié)細(xì)胞在第一天接種時在培養(yǎng)瓶底均勻散在分布，呈球形體折光好；培養(yǎng) 24 小時后可見部分神經(jīng)節(jié)細(xì)胞貼壁伸展，大部分細(xì)胞仍懸浮(圖 2A養(yǎng) 48 小時可見貼壁神經(jīng)節(jié)細(xì)胞顯著增多；可換液去除表面懸浮的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。7 右可以觀察到有明顯軸突、樹突及軸丘。(圖 2B)。轉(zhuǎn)染鼠來源 melanopsin 腺病毒前見原代神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)育較成熟，細(xì)胞狀態(tài)佳，可進(jìn)行鼠來源 melanopsin 腺病毒轉(zhuǎn)圖 2C)。當(dāng)轉(zhuǎn)染病毒 24 小時后，可以觀察到明顯綠色熒光 GFP 表達(dá)(圖 2D)。將細(xì)胞培養(yǎng)片由 24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中移出，PBS 漂洗 3 次后用 4%多聚甲醛固定爬片后進(jìn)行免疫組化染色，鑒定表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞是否為神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，結(jié)果顯示染鼠來源腺病毒后表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞可以表達(dá)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞特異性蛋白 thy1.1，

原代神經(jīng)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)及鼠來源 melanopsin-AV 腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。 A 圖為原代神經(jīng)節(jié)細(xì)胞觀察，可見少量細(xì)胞貼壁，其余仍未懸浮細(xì)胞；B 圖為原代神經(jīng)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng) 7 天后，可細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，，胞體呈類三角形隆起，軸突及樹突生長較好，細(xì)胞間聯(lián)系緊密；C 圖為節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)染病毒前的狀態(tài)，挑選狀態(tài)佳的細(xì)胞片進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染；D 圖為轉(zhuǎn)染鼠來源 mela毒后 24 小時觀察其熒光表達(dá)情況：可見明顯綠色熒光表達(dá)。(標(biāo)尺：A 、B 100μm、C、D
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R774.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 周華祥,劉文舟,段俊國,江文珊,陳曉莉;電針不同穴位對單眼視神經(jīng)離斷家兔FVEP的影響[J];中國針灸;2005年10期

本文編號：2528927