【摘要】：視網(wǎng)膜干細胞是一類能保持未分化狀態(tài)并且能自我更新、產(chǎn)生視網(wǎng)膜各種類型細胞的細胞。在早期胚胎發(fā)育過程中及成年動物都存在。在胚胎早期發(fā)育過程中,視網(wǎng)膜干細胞居于視網(wǎng)膜細胞譜系的最頂端,最早產(chǎn)生的視網(wǎng)膜干細胞能在不斷的發(fā)育過程中按照特定的順序產(chǎn)生出節(jié)細胞,水平細胞,視錐細胞,無長突細胞,視感細胞,雙極細胞和Muller膠質(zhì)細胞；在成年脊椎動物尤其是在較低等的魚和蛙中,睫狀緣區(qū)(ciliary marginal zone, CMZ)細胞能持續(xù)終生產(chǎn)生出新的視網(wǎng)膜細胞,加入到視網(wǎng)膜的組織中。而在較高等的脊椎動物鵪鶉和雞中,位于睫狀緣區(qū)的細胞主要產(chǎn)生雙極細胞和無長突細胞,在眼組織受損后加入到視網(wǎng)膜修補損傷。在小鼠和人類,來源于CMZ的細胞在體外培養(yǎng)中能形成視網(wǎng)膜干細胞樣的細胞球,并且可以產(chǎn)生視網(wǎng)膜神經(jīng)元,這些細胞被認為是成體中的視網(wǎng)膜干細胞。 但是到目前為止,視網(wǎng)膜干細胞的分子特征仍不得而知。而且在早期胚胎發(fā)育中位于細胞譜系頂端的視網(wǎng)膜干細胞和成體視網(wǎng)膜干細胞是否一樣也無從知曉。目前使用眼發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Pax6,Sox1,Sox2,Otx2,MITF,Chx10, Six3和Rx中的一種或者組合來界定視網(wǎng)膜干細胞,但這會出現(xiàn)問題：這些轉(zhuǎn)錄因子中的大部分(Pax6,Sox1,Sox2,Otx2,Six3和Rx)不僅在早期眼發(fā)育中表達,在神經(jīng)外胚層中也廣泛表達,難以區(qū)分視網(wǎng)膜干細胞和神經(jīng)干細胞,尤其是在體外培養(yǎng)的條件下。而且,作為眼發(fā)育中的“總基因”的Pax6,在哺乳動物的神經(jīng)外胚層普遍表達。因此,視網(wǎng)膜干細胞的分子標記的問題亟待解決,這也能給視網(wǎng)膜干細胞的界定,分離,維持,以及今后可能的臨床應用打下堅實的基礎(chǔ)。 在本研究中,我們對早期胚胎的不同時期標本進行切片染色,找到了早期胚胎眼發(fā)育的一系列相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的動態(tài)表達規(guī)律,包括Pax6,Sox1,Sox2,Otx2, MITF,Chx10,Six3,Rx。發(fā)現(xiàn)在胚胎眼發(fā)育的最早期,Pax6,Otx2,Six3和Rx廣泛表達于神經(jīng)外胚層,Soxl在視泡不表達而Sox2表達減弱。MITF僅表達于視泡背側(cè)。而且Pax6的熒光強度在視泡部位高于周圍的神經(jīng)外胚層。因此,視網(wǎng)膜干細胞可以用三個轉(zhuǎn)錄因子Pax6,MITF和Soxl來界定,因此找到了人視網(wǎng)膜干細胞的分子標志,解決了長期以來困擾這一研究領(lǐng)域的難題。 在早期胚胎中找到視網(wǎng)膜干細胞的分子標志對于我們在體外用胚胎干細胞誘導分化出視網(wǎng)膜干細胞有非常重要的指引意義。在我們的傳統(tǒng)的神經(jīng)分化體系中,培養(yǎng)12天時有4%的Pax6+/MTF+/Sox1-的細胞,而在第15天這些細胞趨于消失。這些細胞的出現(xiàn)及出現(xiàn)的時間都符合發(fā)育生物學規(guī)律。 轉(zhuǎn)入視網(wǎng)膜分化體系中培養(yǎng)后,第12天有13%的Pax6+/MITF+/Sox1-細胞出現(xiàn),為了找到能促進視網(wǎng)膜干細胞產(chǎn)生的胞外分子,我們在培養(yǎng)體系中分別加入了在動物實驗中報道的能促進視網(wǎng)膜干細胞/前體細胞的一些胞外因子,包括SHH,BMP4,FGF8,Wnt3a, DKK1和IGF。但是這些因子在體外培養(yǎng)的條件下并沒有促進視網(wǎng)膜干細胞產(chǎn)生的作用。 經(jīng)過6周的培養(yǎng),視網(wǎng)膜干細胞形成的神經(jīng)球中,超過90%都是視網(wǎng)膜神經(jīng)球。在體外誘導分化的早期階段,是視網(wǎng)膜干細胞出現(xiàn)的時期,隨著誘導分化的進行,視網(wǎng)膜干細胞并不維持在干細胞狀態(tài)而是繼續(xù)分化為神經(jīng)視網(wǎng)膜和色素上皮細胞,形成細胞排列規(guī)律的神經(jīng)視網(wǎng)膜細胞球和黑色的色素上皮細胞球。而分別加入向神經(jīng)視網(wǎng)膜分化促進的因子FGF2和向色素上皮層分化促進的因子ActivinA后,能有效的向這兩種特定細胞類型方向誘導。因此,我們分化系統(tǒng)中的視網(wǎng)膜干細胞能夠被調(diào)控產(chǎn)生出神經(jīng)視網(wǎng)膜細胞和色素上皮細胞。 在LIF,CHIR99021和B27存在的條件下,視網(wǎng)膜干細胞能維持在未分化狀態(tài),重回誘導分化系統(tǒng)后,這些視網(wǎng)膜干細胞能重新分化為神經(jīng)視網(wǎng)膜和色素上皮細胞。這些結(jié)果顯示,從人早期胚胎發(fā)育中找到的Pax6, MITF和Sox1的確是真正的視網(wǎng)膜干細胞的特征性轉(zhuǎn)錄因子,因此解決了在視網(wǎng)膜發(fā)育研究領(lǐng)域的重要難題,而運用這一分子標志能準確在體外誘導分化體系中找到視網(wǎng)膜干細胞,為視網(wǎng)膜發(fā)育機制的研究和今后可能的細胞移植治療視網(wǎng)膜疾病提供關(guān)鍵的細胞模型和種子細胞。
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R774.1

【參考文獻】

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1 李成章,樊明文,唐志姣;人牙骨質(zhì)、牙周膜、牙槽骨中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原的檢測[J];中華口腔醫(yī)學雜志;1997年02期

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本文編號：2519814