【摘要】：視網(wǎng)膜干細(xì)胞是一類能保持未分化狀態(tài)并且能自我更新、產(chǎn)生視網(wǎng)膜各種類型細(xì)胞的細(xì)胞。在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中及成年動(dòng)物都存在。在胚胎早期發(fā)育過(guò)程中,視網(wǎng)膜干細(xì)胞居于視網(wǎng)膜細(xì)胞譜系的最頂端,最早產(chǎn)生的視網(wǎng)膜干細(xì)胞能在不斷的發(fā)育過(guò)程中按照特定的順序產(chǎn)生出節(jié)細(xì)胞,水平細(xì)胞,視錐細(xì)胞,無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞,視感細(xì)胞,雙極細(xì)胞和Muller膠質(zhì)細(xì)胞；在成年脊椎動(dòng)物尤其是在較低等的魚(yú)和蛙中,睫狀緣區(qū)(ciliary marginal zone, CMZ)細(xì)胞能持續(xù)終生產(chǎn)生出新的視網(wǎng)膜細(xì)胞,加入到視網(wǎng)膜的組織中。而在較高等的脊椎動(dòng)物鵪鶉和雞中,位于睫狀緣區(qū)的細(xì)胞主要產(chǎn)生雙極細(xì)胞和無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞,在眼組織受損后加入到視網(wǎng)膜修補(bǔ)損傷。在小鼠和人類,來(lái)源于CMZ的細(xì)胞在體外培養(yǎng)中能形成視網(wǎng)膜干細(xì)胞樣的細(xì)胞球,并且可以產(chǎn)生視網(wǎng)膜神經(jīng)元,這些細(xì)胞被認(rèn)為是成體中的視網(wǎng)膜干細(xì)胞。 但是到目前為止,視網(wǎng)膜干細(xì)胞的分子特征仍不得而知。而且在早期胚胎發(fā)育中位于細(xì)胞譜系頂端的視網(wǎng)膜干細(xì)胞和成體視網(wǎng)膜干細(xì)胞是否一樣也無(wú)從知曉。目前使用眼發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Pax6,Sox1,Sox2,Otx2,MITF,Chx10, Six3和Rx中的一種或者組合來(lái)界定視網(wǎng)膜干細(xì)胞,但這會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題：這些轉(zhuǎn)錄因子中的大部分(Pax6,Sox1,Sox2,Otx2,Six3和Rx)不僅在早期眼發(fā)育中表達(dá),在神經(jīng)外胚層中也廣泛表達(dá),難以區(qū)分視網(wǎng)膜干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞,尤其是在體外培養(yǎng)的條件下。而且,作為眼發(fā)育中的“總基因”的Pax6,在哺乳動(dòng)物的神經(jīng)外胚層普遍表達(dá)。因此,視網(wǎng)膜干細(xì)胞的分子標(biāo)記的問(wèn)題亟待解決,這也能給視網(wǎng)膜干細(xì)胞的界定,分離,維持,以及今后可能的臨床應(yīng)用打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 在本研究中,我們對(duì)早期胚胎的不同時(shí)期標(biāo)本進(jìn)行切片染色,找到了早期胚胎眼發(fā)育的一系列相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的動(dòng)態(tài)表達(dá)規(guī)律,包括Pax6,Sox1,Sox2,Otx2, MITF,Chx10,Six3,Rx。發(fā)現(xiàn)在胚胎眼發(fā)育的最早期,Pax6,Otx2,Six3和Rx廣泛表達(dá)于神經(jīng)外胚層,Soxl在視泡不表達(dá)而Sox2表達(dá)減弱。MITF僅表達(dá)于視泡背側(cè)。而且Pax6的熒光強(qiáng)度在視泡部位高于周圍的神經(jīng)外胚層。因此,視網(wǎng)膜干細(xì)胞可以用三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Pax6,MITF和Soxl來(lái)界定,因此找到了人視網(wǎng)膜干細(xì)胞的分子標(biāo)志,解決了長(zhǎng)期以來(lái)困擾這一研究領(lǐng)域的難題。 在早期胚胎中找到視網(wǎng)膜干細(xì)胞的分子標(biāo)志對(duì)于我們?cè)隗w外用胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化出視網(wǎng)膜干細(xì)胞有非常重要的指引意義。在我們的傳統(tǒng)的神經(jīng)分化體系中,培養(yǎng)12天時(shí)有4%的Pax6+/MTF+/Sox1-的細(xì)胞,而在第15天這些細(xì)胞趨于消失。這些細(xì)胞的出現(xiàn)及出現(xiàn)的時(shí)間都符合發(fā)育生物學(xué)規(guī)律。 轉(zhuǎn)入視網(wǎng)膜分化體系中培養(yǎng)后,第12天有13%的Pax6+/MITF+/Sox1-細(xì)胞出現(xiàn),為了找到能促進(jìn)視網(wǎng)膜干細(xì)胞產(chǎn)生的胞外分子,我們?cè)谂囵B(yǎng)體系中分別加入了在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中報(bào)道的能促進(jìn)視網(wǎng)膜干細(xì)胞/前體細(xì)胞的一些胞外因子,包括SHH,BMP4,FGF8,Wnt3a, DKK1和IGF。但是這些因子在體外培養(yǎng)的條件下并沒(méi)有促進(jìn)視網(wǎng)膜干細(xì)胞產(chǎn)生的作用。 經(jīng)過(guò)6周的培養(yǎng),視網(wǎng)膜干細(xì)胞形成的神經(jīng)球中,超過(guò)90%都是視網(wǎng)膜神經(jīng)球。在體外誘導(dǎo)分化的早期階段,是視網(wǎng)膜干細(xì)胞出現(xiàn)的時(shí)期,隨著誘導(dǎo)分化的進(jìn)行,視網(wǎng)膜干細(xì)胞并不維持在干細(xì)胞狀態(tài)而是繼續(xù)分化為神經(jīng)視網(wǎng)膜和色素上皮細(xì)胞,形成細(xì)胞排列規(guī)律的神經(jīng)視網(wǎng)膜細(xì)胞球和黑色的色素上皮細(xì)胞球。而分別加入向神經(jīng)視網(wǎng)膜分化促進(jìn)的因子FGF2和向色素上皮層分化促進(jìn)的因子ActivinA后,能有效的向這兩種特定細(xì)胞類型方向誘導(dǎo)。因此,我們分化系統(tǒng)中的視網(wǎng)膜干細(xì)胞能夠被調(diào)控產(chǎn)生出神經(jīng)視網(wǎng)膜細(xì)胞和色素上皮細(xì)胞。 在LIF,CHIR99021和B27存在的條件下,視網(wǎng)膜干細(xì)胞能維持在未分化狀態(tài),重回誘導(dǎo)分化系統(tǒng)后,這些視網(wǎng)膜干細(xì)胞能重新分化為神經(jīng)視網(wǎng)膜和色素上皮細(xì)胞。這些結(jié)果顯示,從人早期胚胎發(fā)育中找到的Pax6, MITF和Sox1的確是真正的視網(wǎng)膜干細(xì)胞的特征性轉(zhuǎn)錄因子,因此解決了在視網(wǎng)膜發(fā)育研究領(lǐng)域的重要難題,而運(yùn)用這一分子標(biāo)志能準(zhǔn)確在體外誘導(dǎo)分化體系中找到視網(wǎng)膜干細(xì)胞,為視網(wǎng)膜發(fā)育機(jī)制的研究和今后可能的細(xì)胞移植治療視網(wǎng)膜疾病提供關(guān)鍵的細(xì)胞模型和種子細(xì)胞。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R774.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 李成章,樊明文,唐志姣;人牙骨質(zhì)、牙周膜、牙槽骨中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原的檢測(cè)[J];中華口腔醫(yī)學(xué)雜志;1997年02期

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本文編號(hào)：2519814