【摘要】：研究目的：腧穴敷貼治療變應(yīng)性鼻炎因其在臨床的廣泛應(yīng)用及確切的療效,相關(guān)的效應(yīng)及機(jī)制探討已成為近年的研究熱點(diǎn),并取得了一定的研究成果。根據(jù)腧穴敷貼治療變應(yīng)性鼻炎計(jì)量學(xué)和Meta分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn),既往的研究雖然肯定了其臨床療效,但高質(zhì)量的文獻(xiàn)很少。機(jī)理研究有涉及AR發(fā)病機(jī)制中Th細(xì)胞亞群Th1/Th2的失衡關(guān)系,但并不深入,缺乏對(duì)近年免疫研究熱點(diǎn)Th細(xì)胞另外兩個(gè)亞群,Treg細(xì)胞和Th17的相關(guān)研究。目前臨床使用的腧穴敷貼藥物為中藥散劑,存在藥粉顆粒大小不一,很難混合均勻,影響貼敷效果的問(wèn)題。因此,本研究擬從兩個(gè)方面進(jìn)行：一是采用細(xì)胞破壁,生物利用率高,能充分混勻且利于吸收的中藥超微粉來(lái)進(jìn)行腧穴敷貼,選取大椎、肺俞、腎俞穴治療變應(yīng)性鼻炎大鼠并觀(guān)察其療效；二是探尋超微粉治療AR的可能機(jī)制,尤其是在既往研究的基礎(chǔ)上深入探討超微粉腧穴敷貼治療對(duì)AR大鼠Th1、Th2、Treg和Th17細(xì)胞亞群的可能影響,以及細(xì)胞亞群之間的相互作用。 方法：造模與分組：全部56只SD大鼠,雄性28只,雌性28只,2月齡。分籠喂養(yǎng),每籠6只。按隨機(jī)數(shù)字表原則分成兩組：正常對(duì)照組10只(雄5,雌5)；造模組46只(雄23,雌23)。適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后,造模組46只大鼠予卵清蛋白10mg+Al(OH)3粉末30mmg+生理鹽水1m1制成混懸液腹腔內(nèi)注射,隔日1次/d,共7次,作為基礎(chǔ)致敏。第15天開(kāi)始加強(qiáng)免疫,予5%OVA50u1噴鼻/(側(cè)·日)和1%OVA噴霧吸入5min,連續(xù)7天。3周后,造模組46只大鼠中,有6只死于造模過(guò)程中(雄2只,雌4只),考慮為腹腔注射誤注入大腸所致,剩余40只大鼠在末次激發(fā)后30min,1小時(shí)分別觀(guān)察大鼠搔鼻、噴嚏、鼻溢等行為,并采用疊加計(jì)分法進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分,所有大鼠評(píng)分均超過(guò)5分,顯示本組造模全部成功。將造模成功的AR模型大鼠再按隨機(jī)數(shù)字表原則隨機(jī)分為4組：模型組10只(雄6只,雌4只)；丙酸氟替卡松噴鼻劑組10只(雄5只,雌5只)；普通粉組10只(雄5只,雌5只)；超微粉組10只(雄5只,雌5只)。以上5組50只大鼠進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)。 穴位定位：大鼠大椎、肺俞、腎俞定位參考《常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位定位》。大椎位于第7頸椎與第1胸椎間,背部正中。肺俞位于第3胸椎下兩旁肋間。腎俞位于第2腰椎下兩旁。 普通粉以及超微粉的制備：普通粉、超微粉均選用符合《中華人民共和國(guó)藥典》(2005版)中藥飲片炮制規(guī)范,中藥廣州致信中藥飲片有限公司生產(chǎn),批號(hào)為080710。①普通粉：白芥子粉、延胡索粉、細(xì)辛粉、生甘遂粉,按照2：2：1：1的比例配置；②超微粉：將按比例配置好的普通粉由廣州市第二中醫(yī)院藥劑科使用微粉機(jī),振動(dòng)電機(jī)功率為1.5FW,加工15分鐘,粉碎成粒徑范圍0.1～75μm,粒度分布中心D50≈10～15μm,達(dá)300目以上的超微粉。 實(shí)驗(yàn)措施：①正常對(duì)照組：不采取任何處理措施；②模型組：給予生理鹽水滴鼻,每日1次10天；③丙酸氟替卡松組：丙酸氟替卡松鼻噴霧劑噴鼻,每日1次,每次50gg/側(cè)10天；④普通粉組：首先進(jìn)行備皮,將按比例配置好的普通粉與新鮮姜汁調(diào)和均勻,制成約0.5cm0.5cm大小的藥塊,用3cm3cm次性紙膠布固定于穴位,再使用一次性透氣孔膠布纏繞1-2圈以加固藥貼。每次貼藥4h10天；⑤超微粉組：貼敷藥物改為超微粉,方法同上。 實(shí)驗(yàn)觀(guān)察指標(biāo)與檢測(cè)： ①行為學(xué)觀(guān)察：于末次治療后30min、1小時(shí)觀(guān)察大鼠搔鼻、噴嚏、鼻溢等行為的變化。記分方法：鼻癢：輕度搔癢1-2次為1分,劇烈搔癢抓鼻四周2分。噴嚏：1-3個(gè)為1分,4-10個(gè)為2分；11個(gè)以上為3分。清涕：流至鼻孔為1分,超出前鼻孔為2分,涕流滿(mǎn)面為3分。采用疊加計(jì)分法。 ②鼻黏膜組織HE染色及嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)觀(guān)察：將各組大鼠于末次相關(guān)處理后,在10%水合氯醛,3ml/kg麻醉后,斷頭處死大鼠,迅速剝除上頜骨部皮膚,將上頜骨從顱骨中分離出來(lái),打開(kāi)鼻背,沿鼻中線(xiàn)切開(kāi),暴露鼻中隔和雙側(cè)鼻腔,分離鼻中隔與鼻黏膜,取雙側(cè)鼻黏膜。放入10%甲醛溶液中固定,石蠟包埋,常規(guī)切片行蘇木精—伊紅染色,光學(xué)顯微鏡下觀(guān)測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠鼻黏膜組織學(xué)改變。每張病理切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(1040)計(jì)數(shù),每只大鼠鼻黏膜組織中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)作為一個(gè)計(jì)數(shù)。 ③透射電子顯微鏡觀(guān)察：鼻黏膜離體后必須在2分鐘內(nèi),將標(biāo)本置入2.5%戊二醛液中,4℃冰箱過(guò)夜。固定后的標(biāo)本用磷酸緩沖液沖洗,并浸泡過(guò)夜。1%鋨酸緩沖液固定1h,梯度乙醇脫水,Epon812包埋,聚合,超薄切片,醋酸鈾、枸櫞酸鉛雙重染色,用日立JEM1200-EX透射電子顯微鏡觀(guān)察。 ④免疫學(xué)指標(biāo)測(cè)定：按照試劑盒說(shuō)明采用酶聯(lián)免疫法,檢測(cè)血清中IL-4、TGF-β1、IFN-γ、IL-17的含量。 統(tǒng)計(jì)方法：行為學(xué)改變采用等級(jí)資料Kruskal-Wallis多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn),嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)及血清IFN-γ、IL-4,TGF-β1,IL-17采用單因素方差分析,多重比較采用LSD法,采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析,P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)果：行為學(xué)觀(guān)察結(jié)果：①模型組與正常對(duì)照組在鼻癢、噴嚏、清涕等記分相比,分差顯著,說(shuō)明應(yīng)用卵清蛋白致敏建立的AR動(dòng)物模型成功；②由于非參數(shù)檢驗(yàn)不能做多重比較,從平均秩次看三種治療手段均有效,超微粉組從評(píng)分看治療效果最好,丙酸氟替卡松次之,普通粉效果稍差,說(shuō)明超微粉、普通粉和丙酸倍氯米松鼻噴霧劑均能明顯改善變應(yīng)性鼻炎的鼻癢、噴嚏、清涕等癥狀,使過(guò)變應(yīng)性鼻炎大鼠癥狀得以大部或部分恢復(fù)。 嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果：模型組較正常對(duì)照組大幅升高,提示造模成功,超微粉組EOS計(jì)數(shù)較模型組及普通粉組顯著下降(P0.01),較丙酸氟替卡松組亦顯著下降(P0.05),與正常對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.539),提示超微粉治療大鼠變應(yīng)性鼻炎局部療效肯定；丙酸氟替卡松組及普通粉組EOS計(jì)數(shù)較模型組均明顯下降(P0.05),丙酸氟替卡松組EOS計(jì)數(shù)較普通粉組明顯降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),提示普通粉治療變應(yīng)性鼻炎效果不如鼻內(nèi)激素。 HE染色圖片分析表明：模型組與正常對(duì)照組比較炎癥反應(yīng)明顯,毛細(xì)血管擴(kuò)張、鼻黏膜上皮腫脹,滲透性增強(qiáng),有大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)固有層和血管周?chē)?說(shuō)明變應(yīng)性鼻炎SD大鼠造模成功。藥物干預(yù)的三組與模型組比較均很大程度的減輕了炎癥反應(yīng),表現(xiàn)在上皮無(wú)明顯腫脹,毛細(xì)血管擴(kuò)張不明顯,滲透性減少,以及無(wú)或者少量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)固有層和血管周?chē)?說(shuō)明藥物干預(yù)組的治療均達(dá)到預(yù)期的目標(biāo),可以緩解變應(yīng)性鼻炎SD大鼠的鼻黏膜炎癥反應(yīng)。從三組圖片結(jié)果看同EOS計(jì)數(shù)結(jié)果相似：丙酸氟替卡松組和超微粉組療效優(yōu)于普通粉組,但從HE染色的圖片分析,丙酸氟替卡松組和超微粉組差異不大。 透射電子顯微鏡結(jié)果：模型組與正常對(duì)照組比較炎癥反應(yīng)明顯,粘膜表面不完整,纖毛稀松畸形,見(jiàn)粗短纖毛、微絨毛,部分脫落,纖毛根部連接不完整,細(xì)胞內(nèi)見(jiàn)腫脹線(xiàn)粒體及大小不等空泡,部分線(xiàn)粒體脊丟失,說(shuō)明變應(yīng)性鼻炎SD大鼠造模成功。藥物干預(yù)的三組與模型組比較均有明顯所改善,表現(xiàn)在粘膜表面基本完整,纖毛、微絨毛數(shù)量較模型組明顯增多,細(xì)胞連接正常,超微粉組細(xì)胞內(nèi)甚至可見(jiàn)正常內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線(xiàn)粒體,接近正常對(duì)照組的圖片。說(shuō)明藥物干預(yù)組的治療都達(dá)到預(yù)期的目標(biāo),可以緩解變應(yīng)性鼻炎SD大鼠的鼻黏膜炎癥反應(yīng)。從三組圖片結(jié)果看同EOS計(jì)數(shù)及HE染色結(jié)果相似：丙酸氟替卡松組和超微粉組療效優(yōu)于普通粉組,但與HE染色略微有差異的是超微粉組的透射電子顯微鏡圖片可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)正常內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線(xiàn)粒體,更接近于正常對(duì)照組的圖片結(jié)果,療效較丙酸氟替卡松組更好。 血清學(xué)觀(guān)察結(jié)果：IFN-γ模型組較正常對(duì)照組大幅降低,提示造模成功,超微粉組IFN-γ較模型組、普通粉組及丙酸氟替卡松組顯著升高(P0.05),與正常對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.584),丙酸氟替卡松組較模型組含量升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),普通粉組較模型組相比含量升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),而丙酸氟替卡松與普通粉之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.179),綜合分析結(jié)果提示：超微粉、丙酸氟替卡松及普通粉治療大鼠變應(yīng)性鼻炎均顯著升高了過(guò)敏導(dǎo)致的血清IFN-γ異常降低,同時(shí)超微粉效果最好,普通粉與鼻內(nèi)激素效果相當(dāng)。 IL-4模型組較正常對(duì)照組大幅升高,提示造模成功,超微粉組IL-4較模型組、普通粉組顯著降低(P0.05),與正常對(duì)照組及丙酸氟替卡松組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=-0.095、0.07),丙酸氟替卡松組較模型組含量下降,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),普通粉組較模型組相比含量下降,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),而丙酸氟替卡松與普通粉之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.396),綜合分析結(jié)果提示：超微粉、丙酸氟替卡松及普通粉治療大鼠變應(yīng)性鼻炎均顯著降低了過(guò)敏導(dǎo)致的血清IL-4異常升高,同時(shí)超微粉與鼻內(nèi)激素效果相當(dāng)。 TGF-β1模型組較正常對(duì)照組大幅升高,提示造模成功,超微粉組TGF-β1較模型組、普通粉組及丙酸氟替卡松組顯著下降(P0.05),與正常對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.05),丙酸氟替卡松組較模型組含量下降,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),普通粉組較模型組相比含量下降,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),而丙酸氟替卡松與普通粉之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.993),綜合分析結(jié)果提示：超微粉、丙酸氟替卡松及普通粉治療大鼠變應(yīng)性鼻炎均顯著降低了過(guò)敏導(dǎo)致的血清TGF-β1異常升高,同時(shí)超微粉效果最好,普通粉與鼻內(nèi)激素效果相當(dāng)。 IL-17模型組較正常對(duì)照組大幅升高,提示造模成功,超微粉組IL-17較模型組、普通粉組及丙酸氟替卡松組顯著下降(P0.05),與正常對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.903),丙酸氟替卡松組較模型組含量下降,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),普通粉組較模型組相比含量下降,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),丙酸氟替卡松組較普通粉組IL-17升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.01),綜合分析結(jié)果提示：超微粉、丙酸氟替卡松及普通粉治療大鼠變應(yīng)性鼻炎均降低了過(guò)敏導(dǎo)致的血清IL-17異常升高,同時(shí)超微粉效果最好,鼻內(nèi)激素次之,普通粉稍差。 結(jié)論：造模后AD大鼠行為學(xué)評(píng)分均超過(guò)5分,說(shuō)明卵清蛋白腹腔注射是一種可靠地AR造模方法。綜合EOS計(jì)數(shù)、組織HE染色、透射電鏡及血清ELISA結(jié)果：超微粉、丙酸氟替卡松、普通粉組與模型組比均有顯著差異,提示藥物干預(yù)均能下調(diào)AR大鼠的炎癥反應(yīng),有效治療AR。盡管部分結(jié)果有差異,但總的趨勢(shì)一致,顯示超微粉療效優(yōu)于丙酸氟替卡松噴鼻劑及普通粉組,其可能機(jī)制：在藥物及穴位刺激雙重作用下,調(diào)整機(jī)體免疫狀態(tài),下調(diào)局部的炎癥反應(yīng),同時(shí)Th細(xì)胞亞群在Treg細(xì)胞的核心調(diào)節(jié)作用下,使Th1/Th2失衡關(guān)系回歸平衡,在促進(jìn)Th17分化的同時(shí),功能上又抑制了其促炎癥反應(yīng),使整個(gè)精細(xì)而復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)在平衡與拮抗中發(fā)揮免疫功能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R765.21

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2489211