【摘要】：角膜盲是一種因角膜失去功能從而導(dǎo)致視功能喪失的眼病[1]。角膜透明無血管,感覺神經(jīng)非常豐富,任何使角膜透明性、形狀、完整性發(fā)生變化的角膜疾病,都將導(dǎo)致視力的明顯下降。由于角膜位于眼部正前方,在遭受外傷時,角膜最易受到傷害,從而發(fā)生破裂、感染或混濁,其最常見的損傷原因是眼表組織的化學(xué)性燒傷和熱燒傷,常因角膜結(jié)構(gòu)的破壞及角膜新生血管化,而導(dǎo)致視力的嚴(yán)重?fù)p害[2,3]。臨床治療中,角膜移植仍然是目前主要的治療手段,但角膜供體奇缺、移植片遠(yuǎn)期存活率低、術(shù)后不可避免的免疫排斥反應(yīng)等,都進(jìn)一步限制了角膜移植在眼表組織損傷中的應(yīng)用[4,5]。來源于人臍帶組織的間充質(zhì)干細(xì)胞因獲取方便、無創(chuàng),自我更新,低免疫原性及避免了胚胎干細(xì)胞倫理學(xué)爭議等優(yōu)點(diǎn),近年來被廣泛應(yīng)用于臨床研究。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可分化為多種間葉組織細(xì)胞,也可在炎癥和組織創(chuàng)傷過程中分泌細(xì)胞因子促進(jìn)組織再生,因而在組織和細(xì)胞替代治療及再生醫(yī)學(xué)方面具有極大的應(yīng)用價值。本研究中,我們分別通過體外細(xì)胞培養(yǎng)與活體動物兩個實(shí)驗(yàn)階段,共同探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord-derivedmesenchymal stem cells,hUCMSCs)在角膜堿燒傷早期對角膜上皮缺損、角膜混濁、角膜新生血管化、角膜炎癥介質(zhì)釋放等方面的修復(fù)與治療作用。第一部分:人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCMSCs)的分離培養(yǎng)與鑒定目的:建立hUCMSCs標(biāo)準(zhǔn)的分離純化、規(guī)模化培養(yǎng)及分化潛能鑒定體系;解決hUCMSCs凍存及復(fù)蘇中的技術(shù)問題;初步建立hUCMSCs混懸制品的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn),以便獲得足量的細(xì)胞滿足儲存及后期動物實(shí)驗(yàn)研究的需要。方法:無菌分離臍帶組織,制成標(biāo)準(zhǔn)大小的組織塊,將其置于37℃,5%CO2孵育箱中懸浮培養(yǎng),待人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁后,于倒置顯微鏡下行細(xì)胞學(xué)形態(tài)觀察和HE染色;PCR技術(shù)檢測培養(yǎng)獲得的hUCMSCs有無支原體污染;應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面抗原表型;茜素紅和油紅O染色分別用于成骨和成脂誘導(dǎo)分化后鈣質(zhì)及脂滴的觀察鑒定;利用明膠微載體培養(yǎng)系統(tǒng)擴(kuò)增hUCMSCs,在前期hUCMSCs規(guī)�；囵B(yǎng)的基礎(chǔ)上努力探索5L培養(yǎng)體系的工藝條件、細(xì)胞收獲方式;通過對hUCMSCs凍存保護(hù)劑、凍存方式以及復(fù)蘇標(biāo)準(zhǔn)流程的確立,從而解決凍存復(fù)蘇過程中相應(yīng)的技術(shù)問題;CM-Dil染色行臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外標(biāo)記。結(jié)果:我們利用組織塊懸浮法成功分離培養(yǎng)出人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,且無論從組織學(xué)形態(tài),還是支原體檢測都符合間充質(zhì)干細(xì)胞的制備標(biāo)準(zhǔn),細(xì)胞可以表達(dá)多種抗原表型,如CD73、CD90和CD105;但不表達(dá)造血細(xì)胞及與移植排斥相關(guān)的抗原表型,如CD11b、CD19、CD34、CD45和HLA-DR。在條件培養(yǎng)中可成功誘導(dǎo)分化出骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。在明膠微載體培養(yǎng)系統(tǒng)條件下成功擴(kuò)增出大量的hUCMSCs;進(jìn)一步建立了hUCMSCs凍存及復(fù)蘇的標(biāo)準(zhǔn)工藝流程;且hUCMSCs經(jīng)CM-Dil體外染色標(biāo)記后,可高表達(dá)橘紅色熒光。結(jié)論:通過組織塊懸浮法可成功分離培養(yǎng)出符合質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,并且培養(yǎng)獲得的細(xì)胞經(jīng)體外鑒定后,具有間充質(zhì)干細(xì)胞的抗原表型和多向分化的能力;通過微載體培養(yǎng)系統(tǒng)可使得hUCMSCs在體外獲得大量擴(kuò)增;通過對hUCMSCs凍存保護(hù)劑、凍存方式以及復(fù)蘇標(biāo)準(zhǔn)流程的確立,解決了這一過程中相應(yīng)的技術(shù)問題。第二部分:人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對H2O2誘導(dǎo)的人角膜上皮細(xì)胞急性氧化損傷的保護(hù)及抗凋亡作用目的:通過將hUCMSCs與H2O2氧化誘導(dǎo)損傷后的人角膜上皮細(xì)胞共培養(yǎng),觀察hUCMSCs能否對損傷后的人角膜上皮細(xì)胞起到保護(hù)及抗凋亡作用。方法:液氮管中取出已培養(yǎng)好的人角膜上皮細(xì)胞株(SDHCEC),用提前配制好的人角膜上皮細(xì)胞專用培養(yǎng)液(每100ml培養(yǎng)液內(nèi)含EGF 100μl;轉(zhuǎn)鐵蛋白100μl;胰島素100μl;氫化可的松100μl;NEAA 1ml;Glu 1ml;雙抗1ml;胎牛血清10ml及高糖DMEM 86.6ml)進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng),以保證細(xì)胞正常的生長及增殖。待角膜上皮細(xì)胞貼壁傳代后于倒置顯微鏡下行形態(tài)學(xué)及HE染色觀察。免疫熒光染色鑒定其表面標(biāo)記蛋白Cytokeratin 3和Cytokeratin12。建立人角膜上皮細(xì)胞的H2O2氧化誘導(dǎo)損傷模型,于倒置顯微鏡下觀察誘導(dǎo)前后人角膜上皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化和老化情況。死活細(xì)胞染色檢測誘導(dǎo)損傷前后角膜上皮細(xì)胞的死活比例。流式細(xì)胞儀檢測氧化損傷的人角膜上皮細(xì)胞與hUCMSCs在Transwell共培養(yǎng)24h前后,各組細(xì)胞的凋亡比例、活性氧含量及線粒體膜電位的變化情況。ELISA檢測共培養(yǎng)前后生長因子(EGF和b FGF)的表達(dá)情況。結(jié)果:我們通過使用人角膜上皮細(xì)胞的專用培養(yǎng)液進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)后,倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),多次傳代后的人角膜上皮細(xì)胞沒有因?yàn)閭鞔螖?shù)的增多,而出現(xiàn)衰老的跡象,相反仍能保持正常的生長狀態(tài)。培養(yǎng)獲得的人角膜上皮細(xì)胞經(jīng)體外鑒定后,能夠表達(dá)其特有的蛋白標(biāo)志物CK3和CK12。我們利用1m M H2O2進(jìn)行人角膜上皮細(xì)胞氧化誘導(dǎo)24h后發(fā)現(xiàn),細(xì)胞存活率可降低至50%,且細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量較誘導(dǎo)前有明顯的改變。行β-半乳糖苷酶染色后可在鏡下觀察到氧化誘導(dǎo)模型組的人角膜上皮細(xì)胞出現(xiàn)衰老的藍(lán)染顆粒凝集。且經(jīng)死活細(xì)胞染色觀察后發(fā)現(xiàn),H2O2氧化誘導(dǎo)損傷模型組死亡和破裂的人角膜上皮細(xì)胞數(shù)量較誘導(dǎo)前顯著增多。與hUCMSCs行Transwell共培養(yǎng)24h后,人角膜上皮細(xì)胞的凋亡比例、活性氧含量較共培養(yǎng)前顯著減少,同時線粒體膜電位與共培養(yǎng)前相比也有明顯的上調(diào),且各項(xiàng)差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義,分別為細(xì)胞凋亡檢測(t=15.75,p=0.00),活性氧檢測(t=57.71,p=0.00),線粒體膜電位檢測(t=-3.258,p=0.031)。經(jīng)ELISA檢測EGF和b FGF的含量后發(fā)現(xiàn),人角膜上皮細(xì)胞與hUCMSCs共培養(yǎng)24h后,其細(xì)胞液內(nèi)EGF和b FGF含量較共培養(yǎng)前明顯增加,差異同樣具有統(tǒng)計學(xué)意義,分別為EGF(t=-58.291,p=0.00),b FGF(t=-10.272,p=0.01)。結(jié)論:通過共培養(yǎng)的方式,hUCMSCs可對H2O2誘導(dǎo)氧化損傷后的人角膜上皮細(xì)胞起到保護(hù)和抗凋亡作用,我們推測hUCMSCs發(fā)揮作用的方式可能是通過旁分泌某些營養(yǎng)因子以促進(jìn)損傷細(xì)胞修復(fù)和再生。第三部分:結(jié)膜下注射人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對兔角膜堿燒傷的修復(fù)和治療作用目的:通過對堿燒傷后的術(shù)眼行結(jié)膜下人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞注射,觀察人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞能否對兔角膜堿燒傷早期起到修復(fù)和治療作用。方法:建立兔角膜急性堿燒傷模型,熒光素鈉染色觀察角膜上皮損傷面積,HE染色確定損傷深度。將前期制備好的hUCMSCs混懸液和同型陰性對照組溶媒液,行實(shí)驗(yàn)造模眼結(jié)膜下注射,于微距及裂隙燈下進(jìn)行為期2周的動態(tài)觀察,對比hUCMSCs注射組和對照組術(shù)眼的角膜上皮愈合面積、角膜透明度、角膜新生血管(CNV)、前房、結(jié)膜充血、睫狀充血和眼部分泌物等情況。HE染色觀察各組角膜上皮的愈合情況,免疫組織化學(xué)染色觀察各組角膜上皮標(biāo)志蛋白(CK3和CK12)和角膜上皮修復(fù)相關(guān)蛋白(α-SMA和Ki-67)的表達(dá)情況。酶聯(lián)免疫法檢測各組房水中炎癥因子(TNF-α和IL-1β)的表達(dá)情況,以及各組角膜組織勻漿上清液中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF),表皮生長因子(EGF)和角質(zhì)細(xì)胞生長因子(KGF-2)的表達(dá)情況。結(jié)果:成功建立兔角膜急性堿燒傷模型。微距及裂隙燈下觀察發(fā)現(xiàn),經(jīng)hUCMSCs混懸液注射后的實(shí)驗(yàn)組相比同型陰性對照組和空白對照組,其眼部各項(xiàng)指標(biāo),即角膜上皮愈合面積、透明度、角膜新生血管和前房情況等都得到了明顯的改善。于造模術(shù)后第7天,HE染色觀察發(fā)現(xiàn),hUCMSCs注射組角膜上皮已修復(fù)完全,僅存留輕度的基質(zhì)水腫,而對照兩組在水腫的角膜基質(zhì)層可見到大量炎性細(xì)胞浸潤和纖維組織增生。免疫組織化學(xué)染色觀察發(fā)現(xiàn),各組角膜都可表達(dá)CK3和CK12,其中hUCMSCs注射組角膜上皮增殖蛋白Ki-67表達(dá)陽性,對照組為陰性。hUCMSCs注射組基質(zhì)纖維化蛋白α-SMA未見表達(dá),而對照組α-SMA表達(dá)陽性,說明對照組角膜基質(zhì)存在纖維化修復(fù)。酶聯(lián)免疫法檢測各組房水后發(fā)現(xiàn),hUCMSCs注射組TNF-α和IL-1β表達(dá)量均明顯低于對照兩組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,p=0.00。檢測各組角膜組織勻漿上清液后發(fā)現(xiàn),hUCMSCs注射組VEGF的含量明顯低于對照兩組,EGF和KGF-2的含量則明顯高于對照兩組,且差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義,p=0.00。結(jié)論:首次利用結(jié)膜下注射hUCMSCs的方式,能在堿燒傷早期對術(shù)眼角膜起到修復(fù)和治療作用,我們推測hUCMSCs發(fā)揮作用的方式可能是通過其在損傷部位抑制了炎癥介質(zhì)的釋放及VEGF的生成,并通過旁分泌某些營養(yǎng)因子(EGF和KGF-2)以促進(jìn)了損傷組織的修復(fù)和重塑。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R772.2

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本文編號：2480949