【摘要】：第一部分兔堿燒傷角膜緣干細(xì)胞缺乏模型的建立、評(píng)價(jià)及病理改變的研究 目的：建立能夠模擬臨床過程的兔堿燒傷角膜緣干細(xì)胞缺乏模型,為研究堿燒傷造成的角膜緣干細(xì)胞缺乏癥(limbal stem cell deficiency, LSCD)提供科學(xué)、易行的研究模型。 方法：兔堿燒角膜緣干細(xì)胞缺乏模型的建立及評(píng)價(jià)：(1)模型建立：將浸有1mol/L NaOH溶液的內(nèi)徑10mm,外徑18mm的環(huán)形濾紙片置于新西蘭雌性大白兔右眼角膜表面(包括角膜緣)30s,去除濾紙,同時(shí)在結(jié)膜囊內(nèi)滴入1%NaOH1滴,0.9%生理鹽水500m1沖洗結(jié)膜囊,建立兔堿燒傷角膜緣干細(xì)胞缺乏模型。傷后抗生素眼膏點(diǎn)眼1次/晚,常規(guī)飼養(yǎng),定期裂隙燈下觀察、照相；(2)模型評(píng)價(jià)：傷后30天,待炎癥穩(wěn)定后,對(duì)兔堿燒傷角膜緣干細(xì)胞缺乏模型進(jìn)行評(píng)價(jià)：裂隙燈照相、評(píng)分；②印跡細(xì)胞學(xué)檢查角膜結(jié)膜化程度；③活體共聚焦顯微鏡檢查角膜緣及角膜各層結(jié)構(gòu)及病理改變；④淚液分泌試驗(yàn)檢測堿燒傷后淚液分泌情況；(3)病理學(xué)檢查：板層切除傷后30d新生血管化的角膜,進(jìn)行石蠟包埋后HE染色行組織病理學(xué)檢查。 結(jié)果：兔堿燒傷角膜緣干細(xì)胞缺乏模型的建立及評(píng)價(jià)：(1)模型建立情況：傷后即見球結(jié)膜缺血,角膜緣蒼白,中央角膜輕度混濁；傷后14d見球結(jié)膜水腫、缺血,角膜混濁、水腫,虹膜紋理欠清,角膜緣新生血管長入；傷后30d,可見角膜混濁、新生血管長入、角膜上皮結(jié)膜化。(2)模型評(píng)價(jià)情況：①裂隙燈檢查：根據(jù)化學(xué)傷臨床評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)傷后30d的模型進(jìn)行評(píng)分,其中86%(43眼/50眼)臨床評(píng)分在6-10分,8%(4眼/50眼)臨床評(píng)分6分,2%(1眼/50眼)10分,2%(1眼/50眼)角膜穿孔,2%(1眼/50眼)發(fā)生眼內(nèi)炎；②印記細(xì)胞學(xué)檢查示：角膜結(jié)膜化,可見杯狀細(xì)胞存在；③活體共聚焦顯微鏡檢查示：角膜緣柵欄結(jié)構(gòu)消失,角膜上皮缺失,纖維組織覆蓋,殘存的角膜上皮細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,大量炎癥細(xì)胞浸潤,角膜上皮層及基質(zhì)內(nèi)見大量新生血管。④淚液分泌實(shí)驗(yàn)顯示堿燒傷眼淚液分泌量較正常眼顯著降低(p=0.0000.05)；(3)病理學(xué)檢查：切除的板層角膜組織表面粗糙不平,由異常增生的結(jié)膜上皮細(xì)胞覆蓋,基質(zhì)內(nèi)可大量炎細(xì)胞浸潤,新生血管叢生 結(jié)論：堿燒傷是構(gòu)建角膜緣干細(xì)胞缺乏模型的有效途徑,利用堿液燒傷角膜緣可以成功的構(gòu)建角膜緣干細(xì)胞缺乏模型,其方法易行、模型穩(wěn)定,可以很好的模擬臨床上堿燒傷造成的角膜緣干細(xì)胞缺乏癥,為進(jìn)一步研究提供了良好的基礎(chǔ)。 第二部分以羊膜為載體的同種異體角膜緣上皮干細(xì)胞膜片移植術(shù)后供體細(xì)胞的命運(yùn)變化 目的： 1.以羊膜為載體構(gòu)建同種異體角膜緣上皮干細(xì)胞膜片,并移植到兔堿燒傷角膜緣干細(xì)胞缺乏模型眼表,建立兔堿燒傷眼表重建模型； 2.術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)檢測移植的供體細(xì)胞存活情況,并在體追蹤供體細(xì)胞移植后的命運(yùn)變化,為臨床治療提供參考。 方法： 1.以羊膜為載體的同種異體角膜緣上皮干細(xì)胞膜片的構(gòu)建：(1)細(xì)胞培養(yǎng)：取新西蘭大白兔雄兔角膜緣組織,通過消化法獲取角膜緣上皮干細(xì)胞,以去上皮羊膜為載體培養(yǎng)角膜緣上皮干細(xì)胞膜片。待細(xì)胞長滿羊膜并復(fù)層,進(jìn)行CM-DiI標(biāo)記。(2)細(xì)胞狀態(tài)分析：①細(xì)胞增殖能力檢測：將角膜緣干細(xì)胞接種至96孔板,利用MTT法檢測培養(yǎng)1-7天的角膜緣干細(xì)胞增殖能力；②細(xì)胞標(biāo)志物檢測：將少部分培養(yǎng)好的角膜緣上皮干細(xì)胞膜片進(jìn)行HE染色、免疫熒光化學(xué)檢測角膜緣干細(xì)胞標(biāo)志物ABCG2、p63及角膜上皮標(biāo)志物CK3表達(dá)情況；PCR檢測ABCG2、p63及CK3基因表達(dá)情況；③細(xì)胞衰老、凋亡及壞死檢測：將培養(yǎng)好的角膜緣上皮干細(xì)胞膜片進(jìn)行鋪片,通過p-半乳糖苷酶染色法、TUNEL法及臺(tái)盼藍(lán)-茜素紅染色分別檢測細(xì)胞衰老、凋亡及壞死情況。 2.同種異體角膜緣上皮干細(xì)胞膜片移植術(shù)及術(shù)后供體細(xì)胞變化情況：(1)兔眼表重建模型建立：對(duì)堿燒傷角膜緣干細(xì)胞缺乏的模型兔進(jìn)行血管膜切除+同種異體角膜緣上皮干細(xì)胞膜片移植術(shù),術(shù)后縫合瞼裂,按照臨床常規(guī)用藥,建立兔堿燒傷眼表重建模型；(2)術(shù)后供體細(xì)胞存活情況檢測：術(shù)后7,30,60,90d取角膜,進(jìn)行冰凍切片,熒光顯微鏡下觀察標(biāo)記有CM-DiI的供體細(xì)胞的位置和數(shù)量；PCR檢測Y染色體性別決定基因(SRY)表達(dá)情況,追蹤供體細(xì)胞的存活情況。(3)術(shù)后供體細(xì)胞變化情況：術(shù)后1,3,7,30,60,90d通過組織病理學(xué)檢測、免疫熒光化學(xué)及PCR等方法檢測供體細(xì)胞分化、衰老、凋亡及壞死情況：①細(xì)胞分化檢測：PCR檢測ABCG2、p63、CK3的基因表達(dá)情況；②細(xì)胞衰老、凋亡及壞死情況檢測：術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)通過β-半乳糖甘酶染色、TUNEL法及臺(tái)盼藍(lán)-茜素紅染色分別檢測移植術(shù)后供體細(xì)胞的衰老、凋亡及壞死情況。 結(jié)果： 1.以羊膜為載體的同種異體角膜緣上皮干細(xì)胞膜片構(gòu)建：(1)細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞接種后可在去上皮羊膜上粘附生長,并逐漸鋪滿羊膜表面,氣-液界面培養(yǎng)(air-lifting)后可復(fù)至4-5層；(2)角膜緣上皮干細(xì)胞狀態(tài)分析：①細(xì)胞增殖能力檢測：MTT法檢測角膜緣干細(xì)胞接種后3d增殖能力顯著增加,6d達(dá)到頂峰,隨后增殖能力下降；②細(xì)胞標(biāo)志物檢測：HE染色可見細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰,著色好,顯微鏡下可見羊膜膠原纖維上角膜緣上皮干細(xì)胞生長,可復(fù)至4-5層,細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,形態(tài)正常,與羊膜連接緊密；免疫組織化學(xué)檢測見ABCG2、 p63、CK3表達(dá)陽性；PCR檢測ABCG2、p63、CK3基因均呈陽性表達(dá)；③細(xì)胞衰老、凋亡及壞死檢測：羊膜鋪片可見羊膜表面極少量衰老、凋亡及壞死細(xì)胞,細(xì)胞生存狀態(tài)良好。 2.同種異體角膜緣上皮干細(xì)胞膜片移植術(shù)及術(shù)后供體細(xì)胞變化情況：(1)兔眼表重建模型建立：對(duì)18例臨床評(píng)分在6-10分之間的堿燒傷模型進(jìn)行了移植手術(shù),術(shù)畢5例(27.8%)羊膜熒光素鈉染色陽性；(2)術(shù)后供體細(xì)胞存活情況：術(shù)后7,30,60d均可檢測到表達(dá)紅色熒光的供體細(xì)胞,SRY基因亦均有表達(dá)；術(shù)后90d時(shí),1例移植成功的角膜中仍可檢測到標(biāo)記紅色熒光的供體細(xì)胞,PCR可檢測到角膜組織中SRY基因的表達(dá),2例移植失敗的角膜中未檢測到標(biāo)記紅色熒光的供體細(xì)胞,亦未檢測到SRY基因的表達(dá)。(3)術(shù)后供體細(xì)胞變化情況：術(shù)后1d見羊膜表面出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞,衰老及壞死細(xì)胞少見；術(shù)后3d羊膜表面凋亡、壞死及衰老細(xì)胞數(shù)量明顯增加,通過DAPI復(fù)染細(xì)胞核發(fā)現(xiàn),這些凋亡、衰老及壞死的細(xì)胞以炎細(xì)胞為主,僅少量為移植的供體細(xì)胞,上皮細(xì)胞數(shù)量較前增多,位于表層的細(xì)胞成團(tuán)分布,有逐漸連接成片的趨勢；術(shù)后7d時(shí)羊膜表面凋亡、壞死及衰老細(xì)胞均較3d時(shí)略有減少,炎細(xì)胞亦有所減少,上皮細(xì)胞數(shù)量及層數(shù)明顯增加,大部分區(qū)域上皮細(xì)胞連接成片；術(shù)后30d大部分模型可形成相對(duì)完整的角膜上皮,但再生的角膜上皮與正常角膜上皮形態(tài)不同,細(xì)胞層數(shù)減少,明顯變薄,基底部缺乏立方形上皮細(xì)胞,以扁平細(xì)胞為主,同時(shí)羊膜下炎細(xì)胞浸潤,淺基質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂,大量凋亡、衰老細(xì)胞存在于此區(qū)；術(shù)后60d部分角膜出現(xiàn)再次新生血管化,熒光顯微鏡下僅可見少量紅色熒光標(biāo)記的供體細(xì)胞存在于角膜上皮基底層中,且部分發(fā)生凋亡／壞死,未血管化的角膜可見1-3層扁平的角膜上皮細(xì)胞,羊膜下仍有炎細(xì)胞浸潤；術(shù)后90d時(shí)絕大部分角膜發(fā)生再次血管化,羊膜下炎細(xì)胞浸潤明顯,僅有1例在術(shù)后90d時(shí)仍維持角膜透明,眼表穩(wěn)定,組織內(nèi)無炎細(xì)胞,未見凋亡及衰老細(xì)胞。 結(jié)論：以羊膜為載體的同種異體角膜緣上皮干細(xì)胞膜片可在一定程度上改善堿燒傷眼表微環(huán)境,重建眼表功能。移植后7d內(nèi)是供體細(xì)胞生存的關(guān)鍵時(shí)期,部分供體細(xì)胞因微環(huán)境改變而發(fā)生凋亡、衰老及壞死,其中凋亡是細(xì)胞死亡的主要形式。7-30d是供體細(xì)胞的抗擊打適應(yīng)期,生存下來的供體細(xì)胞可逐漸在受體眼表存活并分化,形成再生上皮,再生上皮較正常上皮層數(shù)減少,抵抗力差,大部分模型在術(shù)后60d時(shí)即出現(xiàn)角膜再次血管化,供體細(xì)胞逐漸減少并失活,少部分至術(shù)后90d時(shí)仍維持角膜透明,供體細(xì)胞可在受體眼表穩(wěn)定的存活。眼表慢性炎癥微環(huán)境可能是導(dǎo)致供體細(xì)胞死亡的重要因素,術(shù)前及術(shù)后積極抗炎治療是提高移植成功率的關(guān)鍵。 第三部分以羊膜為載體的同種異體角膜緣上皮干細(xì)胞移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)研究 目的：檢測培養(yǎng)的同種異體角膜緣上皮干細(xì)胞移植術(shù)后的免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生時(shí)間、特點(diǎn),并觀察抗排斥藥物治療效果 方法：建立兔堿燒傷眼表重建模型,并根據(jù)手術(shù)及用藥的不同分為四組：A、免疫抑制劑(環(huán)孢素眼液)點(diǎn)眼組；B、免疫抑制劑(環(huán)孢素緩釋藥)結(jié)膜下植入組；C、無免疫抑制劑組；D、自體角膜緣上皮干細(xì)胞移植組。術(shù)后裂隙燈觀察各組免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生情況,并根據(jù)化學(xué)傷臨床評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。取術(shù)后14,30,60d角膜,進(jìn)行冰凍切片,利用免疫熒光化學(xué)方法檢測各組角膜組織中CD4+、D8+T淋巴細(xì)胞表達(dá)情況；PCR檢測CD4、CD8基因表達(dá)情況。 結(jié)果：免疫排斥反應(yīng)主要發(fā)生于術(shù)后30-60d,術(shù)后14d時(shí)各組均無免疫排斥發(fā)生。A、B組分別于術(shù)后30d和60d各發(fā)生1例免疫排斥,C組發(fā)生3例免疫排斥,其中2例于術(shù)后30d,1例于術(shù)后60d,D組無免疫排斥反應(yīng)發(fā)生。A、B、C、D各組均可檢測到角膜基質(zhì)內(nèi)不同程度的CD4+T淋巴細(xì)胞浸潤,A、B、C組可檢測到少量的CD8’T淋巴細(xì)胞,而D組未檢測到CD8’T淋巴細(xì)胞。PCR顯示C組術(shù)后30d時(shí)CD4及CD8基因表達(dá)量顯著上調(diào),與其他三組比較均有顯著性差異。術(shù)后30d時(shí)A組CD4及CD8基因表達(dá)量均高于B組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：盡管與角膜/角膜緣移植相比,體外培養(yǎng)的同種異體角膜緣上皮干細(xì)胞移植術(shù)引發(fā)的免疫排斥反應(yīng)時(shí)間晚,癥狀輕,但仍是影響供體細(xì)胞存活的重要因素。免疫抑制劑的應(yīng)用有利于提高手術(shù)預(yù)后,其應(yīng)用的關(guān)鍵時(shí)期為術(shù)后14-90d。CsA緩釋藥結(jié)膜下植入是一種安全、有效的抗免疫排斥治療手段,但隨緩釋藥物的吸收,免疫排斥反應(yīng)幾率升高,應(yīng)及時(shí)補(bǔ)充免疫抑制劑。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R779.65
【共引文獻(xiàn)】
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本文編號(hào)：
2474321
