【摘要】：第一部分兔堿燒傷角膜緣干細胞缺乏模型的建立、評價及病理改變的研究 目的：建立能夠模擬臨床過程的兔堿燒傷角膜緣干細胞缺乏模型,為研究堿燒傷造成的角膜緣干細胞缺乏癥(limbal stem cell deficiency, LSCD)提供科學(xué)、易行的研究模型。 方法：兔堿燒角膜緣干細胞缺乏模型的建立及評價：(1)模型建立：將浸有1mol/L NaOH溶液的內(nèi)徑10mm,外徑18mm的環(huán)形濾紙片置于新西蘭雌性大白兔右眼角膜表面(包括角膜緣)30s,去除濾紙,同時在結(jié)膜囊內(nèi)滴入1%NaOH1滴,0.9%生理鹽水500m1沖洗結(jié)膜囊,建立兔堿燒傷角膜緣干細胞缺乏模型。傷后抗生素眼膏點眼1次/晚,常規(guī)飼養(yǎng),定期裂隙燈下觀察、照相；(2)模型評價：傷后30天,待炎癥穩(wěn)定后,對兔堿燒傷角膜緣干細胞缺乏模型進行評價：裂隙燈照相、評分；②印跡細胞學(xué)檢查角膜結(jié)膜化程度；③活體共聚焦顯微鏡檢查角膜緣及角膜各層結(jié)構(gòu)及病理改變；④淚液分泌試驗檢測堿燒傷后淚液分泌情況；(3)病理學(xué)檢查：板層切除傷后30d新生血管化的角膜,進行石蠟包埋后HE染色行組織病理學(xué)檢查。 結(jié)果：兔堿燒傷角膜緣干細胞缺乏模型的建立及評價：(1)模型建立情況：傷后即見球結(jié)膜缺血,角膜緣蒼白,中央角膜輕度混濁；傷后14d見球結(jié)膜水腫、缺血,角膜混濁、水腫,虹膜紋理欠清,角膜緣新生血管長入；傷后30d,可見角膜混濁、新生血管長入、角膜上皮結(jié)膜化。(2)模型評價情況：①裂隙燈檢查：根據(jù)化學(xué)傷臨床評分標準對傷后30d的模型進行評分,其中86%(43眼/50眼)臨床評分在6-10分,8%(4眼/50眼)臨床評分6分,2%(1眼/50眼)10分,2%(1眼/50眼)角膜穿孔,2%(1眼/50眼)發(fā)生眼內(nèi)炎；②印記細胞學(xué)檢查示：角膜結(jié)膜化,可見杯狀細胞存在；③活體共聚焦顯微鏡檢查示：角膜緣柵欄結(jié)構(gòu)消失,角膜上皮缺失,纖維組織覆蓋,殘存的角膜上皮細胞形態(tài)不規(guī)則,大量炎癥細胞浸潤,角膜上皮層及基質(zhì)內(nèi)見大量新生血管。④淚液分泌實驗顯示堿燒傷眼淚液分泌量較正常眼顯著降低(p=0.0000.05)；(3)病理學(xué)檢查：切除的板層角膜組織表面粗糙不平,由異常增生的結(jié)膜上皮細胞覆蓋,基質(zhì)內(nèi)可大量炎細胞浸潤,新生血管叢生 結(jié)論：堿燒傷是構(gòu)建角膜緣干細胞缺乏模型的有效途徑,利用堿液燒傷角膜緣可以成功的構(gòu)建角膜緣干細胞缺乏模型,其方法易行、模型穩(wěn)定,可以很好的模擬臨床上堿燒傷造成的角膜緣干細胞缺乏癥,為進一步研究提供了良好的基礎(chǔ)。 第二部分以羊膜為載體的同種異體角膜緣上皮干細胞膜片移植術(shù)后供體細胞的命運變化 目的： 1.以羊膜為載體構(gòu)建同種異體角膜緣上皮干細胞膜片,并移植到兔堿燒傷角膜緣干細胞缺乏模型眼表,建立兔堿燒傷眼表重建模型； 2.術(shù)后不同時間點檢測移植的供體細胞存活情況,并在體追蹤供體細胞移植后的命運變化,為臨床治療提供參考。 方法： 1.以羊膜為載體的同種異體角膜緣上皮干細胞膜片的構(gòu)建：(1)細胞培養(yǎng)：取新西蘭大白兔雄兔角膜緣組織,通過消化法獲取角膜緣上皮干細胞,以去上皮羊膜為載體培養(yǎng)角膜緣上皮干細胞膜片。待細胞長滿羊膜并復(fù)層,進行CM-DiI標記。(2)細胞狀態(tài)分析：①細胞增殖能力檢測：將角膜緣干細胞接種至96孔板,利用MTT法檢測培養(yǎng)1-7天的角膜緣干細胞增殖能力；②細胞標志物檢測：將少部分培養(yǎng)好的角膜緣上皮干細胞膜片進行HE染色、免疫熒光化學(xué)檢測角膜緣干細胞標志物ABCG2、p63及角膜上皮標志物CK3表達情況；PCR檢測ABCG2、p63及CK3基因表達情況；③細胞衰老、凋亡及壞死檢測：將培養(yǎng)好的角膜緣上皮干細胞膜片進行鋪片,通過p-半乳糖苷酶染色法、TUNEL法及臺盼藍-茜素紅染色分別檢測細胞衰老、凋亡及壞死情況。 2.同種異體角膜緣上皮干細胞膜片移植術(shù)及術(shù)后供體細胞變化情況：(1)兔眼表重建模型建立：對堿燒傷角膜緣干細胞缺乏的模型兔進行血管膜切除+同種異體角膜緣上皮干細胞膜片移植術(shù),術(shù)后縫合瞼裂,按照臨床常規(guī)用藥,建立兔堿燒傷眼表重建模型；(2)術(shù)后供體細胞存活情況檢測：術(shù)后7,30,60,90d取角膜,進行冰凍切片,熒光顯微鏡下觀察標記有CM-DiI的供體細胞的位置和數(shù)量；PCR檢測Y染色體性別決定基因(SRY)表達情況,追蹤供體細胞的存活情況。(3)術(shù)后供體細胞變化情況：術(shù)后1,3,7,30,60,90d通過組織病理學(xué)檢測、免疫熒光化學(xué)及PCR等方法檢測供體細胞分化、衰老、凋亡及壞死情況：①細胞分化檢測：PCR檢測ABCG2、p63、CK3的基因表達情況；②細胞衰老、凋亡及壞死情況檢測：術(shù)后不同時間點通過β-半乳糖甘酶染色、TUNEL法及臺盼藍-茜素紅染色分別檢測移植術(shù)后供體細胞的衰老、凋亡及壞死情況。 結(jié)果： 1.以羊膜為載體的同種異體角膜緣上皮干細胞膜片構(gòu)建：(1)細胞培養(yǎng)：細胞接種后可在去上皮羊膜上粘附生長,并逐漸鋪滿羊膜表面,氣-液界面培養(yǎng)(air-lifting)后可復(fù)至4-5層；(2)角膜緣上皮干細胞狀態(tài)分析：①細胞增殖能力檢測：MTT法檢測角膜緣干細胞接種后3d增殖能力顯著增加,6d達到頂峰,隨后增殖能力下降；②細胞標志物檢測：HE染色可見細胞結(jié)構(gòu)清晰,著色好,顯微鏡下可見羊膜膠原纖維上角膜緣上皮干細胞生長,可復(fù)至4-5層,細胞結(jié)構(gòu)完整,形態(tài)正常,與羊膜連接緊密；免疫組織化學(xué)檢測見ABCG2、 p63、CK3表達陽性；PCR檢測ABCG2、p63、CK3基因均呈陽性表達；③細胞衰老、凋亡及壞死檢測：羊膜鋪片可見羊膜表面極少量衰老、凋亡及壞死細胞,細胞生存狀態(tài)良好。 2.同種異體角膜緣上皮干細胞膜片移植術(shù)及術(shù)后供體細胞變化情況：(1)兔眼表重建模型建立：對18例臨床評分在6-10分之間的堿燒傷模型進行了移植手術(shù),術(shù)畢5例(27.8%)羊膜熒光素鈉染色陽性；(2)術(shù)后供體細胞存活情況：術(shù)后7,30,60d均可檢測到表達紅色熒光的供體細胞,SRY基因亦均有表達；術(shù)后90d時,1例移植成功的角膜中仍可檢測到標記紅色熒光的供體細胞,PCR可檢測到角膜組織中SRY基因的表達,2例移植失敗的角膜中未檢測到標記紅色熒光的供體細胞,亦未檢測到SRY基因的表達。(3)術(shù)后供體細胞變化情況：術(shù)后1d見羊膜表面出現(xiàn)大量凋亡細胞,衰老及壞死細胞少見；術(shù)后3d羊膜表面凋亡、壞死及衰老細胞數(shù)量明顯增加,通過DAPI復(fù)染細胞核發(fā)現(xiàn),這些凋亡、衰老及壞死的細胞以炎細胞為主,僅少量為移植的供體細胞,上皮細胞數(shù)量較前增多,位于表層的細胞成團分布,有逐漸連接成片的趨勢；術(shù)后7d時羊膜表面凋亡、壞死及衰老細胞均較3d時略有減少,炎細胞亦有所減少,上皮細胞數(shù)量及層數(shù)明顯增加,大部分區(qū)域上皮細胞連接成片；術(shù)后30d大部分模型可形成相對完整的角膜上皮,但再生的角膜上皮與正常角膜上皮形態(tài)不同,細胞層數(shù)減少,明顯變薄,基底部缺乏立方形上皮細胞,以扁平細胞為主,同時羊膜下炎細胞浸潤,淺基質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂,大量凋亡、衰老細胞存在于此區(qū)；術(shù)后60d部分角膜出現(xiàn)再次新生血管化,熒光顯微鏡下僅可見少量紅色熒光標記的供體細胞存在于角膜上皮基底層中,且部分發(fā)生凋亡／壞死,未血管化的角膜可見1-3層扁平的角膜上皮細胞,羊膜下仍有炎細胞浸潤；術(shù)后90d時絕大部分角膜發(fā)生再次血管化,羊膜下炎細胞浸潤明顯,僅有1例在術(shù)后90d時仍維持角膜透明,眼表穩(wěn)定,組織內(nèi)無炎細胞,未見凋亡及衰老細胞。 結(jié)論：以羊膜為載體的同種異體角膜緣上皮干細胞膜片可在一定程度上改善堿燒傷眼表微環(huán)境,重建眼表功能。移植后7d內(nèi)是供體細胞生存的關(guān)鍵時期,部分供體細胞因微環(huán)境改變而發(fā)生凋亡、衰老及壞死,其中凋亡是細胞死亡的主要形式。7-30d是供體細胞的抗擊打適應(yīng)期,生存下來的供體細胞可逐漸在受體眼表存活并分化,形成再生上皮,再生上皮較正常上皮層數(shù)減少,抵抗力差,大部分模型在術(shù)后60d時即出現(xiàn)角膜再次血管化,供體細胞逐漸減少并失活,少部分至術(shù)后90d時仍維持角膜透明,供體細胞可在受體眼表穩(wěn)定的存活。眼表慢性炎癥微環(huán)境可能是導(dǎo)致供體細胞死亡的重要因素,術(shù)前及術(shù)后積極抗炎治療是提高移植成功率的關(guān)鍵。 第三部分以羊膜為載體的同種異體角膜緣上皮干細胞移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)研究 目的：檢測培養(yǎng)的同種異體角膜緣上皮干細胞移植術(shù)后的免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生時間、特點,并觀察抗排斥藥物治療效果 方法：建立兔堿燒傷眼表重建模型,并根據(jù)手術(shù)及用藥的不同分為四組：A、免疫抑制劑(環(huán)孢素眼液)點眼組；B、免疫抑制劑(環(huán)孢素緩釋藥)結(jié)膜下植入組；C、無免疫抑制劑組；D、自體角膜緣上皮干細胞移植組。術(shù)后裂隙燈觀察各組免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生情況,并根據(jù)化學(xué)傷臨床評分標準進行評分。取術(shù)后14,30,60d角膜,進行冰凍切片,利用免疫熒光化學(xué)方法檢測各組角膜組織中CD4+、D8+T淋巴細胞表達情況；PCR檢測CD4、CD8基因表達情況。 結(jié)果：免疫排斥反應(yīng)主要發(fā)生于術(shù)后30-60d,術(shù)后14d時各組均無免疫排斥發(fā)生。A、B組分別于術(shù)后30d和60d各發(fā)生1例免疫排斥,C組發(fā)生3例免疫排斥,其中2例于術(shù)后30d,1例于術(shù)后60d,D組無免疫排斥反應(yīng)發(fā)生。A、B、C、D各組均可檢測到角膜基質(zhì)內(nèi)不同程度的CD4+T淋巴細胞浸潤,A、B、C組可檢測到少量的CD8’T淋巴細胞,而D組未檢測到CD8’T淋巴細胞。PCR顯示C組術(shù)后30d時CD4及CD8基因表達量顯著上調(diào),與其他三組比較均有顯著性差異。術(shù)后30d時A組CD4及CD8基因表達量均高于B組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論：盡管與角膜/角膜緣移植相比,體外培養(yǎng)的同種異體角膜緣上皮干細胞移植術(shù)引發(fā)的免疫排斥反應(yīng)時間晚,癥狀輕,但仍是影響供體細胞存活的重要因素。免疫抑制劑的應(yīng)用有利于提高手術(shù)預(yù)后,其應(yīng)用的關(guān)鍵時期為術(shù)后14-90d。CsA緩釋藥結(jié)膜下植入是一種安全、有效的抗免疫排斥治療手段,但隨緩釋藥物的吸收,免疫排斥反應(yīng)幾率升高,應(yīng)及時補充免疫抑制劑。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R779.65

【共引文獻】

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本文編號：2474321