【摘要】：目的：1)觀察新制備的經(jīng)聚乙烯亞胺(polyethylenimine, PEI)表面修飾的羥基磷灰石納米載體(hydroxyapatite nanoparticles nHAT)(PEI-nHAT)的生物學(xué)性能,評(píng)估其體外結(jié)合與保護(hù)DNA的能力；2)評(píng)估攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白報(bào)告基因(EGFP)及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素3治療基因(NT-3)的PEI-nHAT載體-基因復(fù)合物(PEI-nHAT-pEGFPC2-NT3)經(jīng)完整圓窗膜途徑向耳蝸轉(zhuǎn)染的安全性及有效性；3)評(píng)估PEI-nHAT-pEGFPC2-NT3經(jīng)完整圓窗膜途徑向前庭轉(zhuǎn)染的安全性及有效性。 方法：1)應(yīng)用化學(xué)共沉淀-水熱合成法制備nHAT,用PEI對(duì)其進(jìn)行表面修飾后,對(duì)PEI-nHAT進(jìn)行透射電鏡觀察并行Zeta電位測(cè)定；觀察PEI-nHAT在體外的分散性及穩(wěn)定性；并在不同濃度下觀察其與DNA結(jié)合能力以及保護(hù)DNA抗核酸酶消化的能力。2)將南美栗鼠分成轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組、空載體轉(zhuǎn)染組及生理鹽水對(duì)照組三組,將其麻醉后,行枕后徑路打開術(shù)耳聽泡,分別將20μl PEI-nHAT-pEGFPC2-NT3復(fù)合物或20μl PEI-nHAT混懸液或20μ1生理鹽水經(jīng)完整圓窗膜途徑向耳蝸轉(zhuǎn)染。在手術(shù)前及轉(zhuǎn)染48小時(shí)后分別測(cè)試雙耳在1kHz、4kHz8kHz、12kHz及16kHz處短純音誘發(fā)的聽性腦干反應(yīng)(Auditory Brainstem Response, ABR)及畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(Distortion Product Otoacoustic Emissions, DPOAE)。聽力學(xué)檢測(cè)完后將動(dòng)物處死,雙側(cè)耳蝸固定、取材,行免疫組織化學(xué)、免疫熒光染色、常規(guī)耳蝸鋪片及冰凍切片,應(yīng)用激光共聚焦熒光顯微鏡進(jìn)行耳蝸組織學(xué)和形態(tài)學(xué)觀察及綠色熒光蛋白定位表達(dá)觀察。3)將南美栗鼠分成轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組、空載體轉(zhuǎn)染組及生理鹽水對(duì)照組三組,將其麻醉后,行枕后徑路打開術(shù)耳聽泡,分別將20μl PEI-nHAT-pEGFPC2-NT3復(fù)合物或20μ1PEI-nHAT混懸液或20μ1生理鹽水經(jīng)完整圓窗膜途徑向內(nèi)耳轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后將動(dòng)物處死,雙側(cè)內(nèi)耳前庭器官固定、取材,行免疫組織化學(xué)、免疫熒光染色、常規(guī)鋪片及冰凍切片,應(yīng)用激光共聚焦熒光顯微鏡進(jìn)行前庭器官組織學(xué)和形態(tài)學(xué)觀察及綠色熒光蛋白在前庭中的定位表達(dá)觀察。 結(jié)果：1)PEI-nHAT顆粒在電鏡下形態(tài)為短棒狀,粒徑均勻,分散性及穩(wěn)定性好,其平均粒徑(X±SD)為73.09±27.32nm；在pH為7、濃度為250μg/ml的條件下,PEI-nHAT的Zeta電位(X±SD)為42.46±10.9mV; PEI-nHAT顆粒在125μg/ml-2000μg/ml濃度范圍內(nèi)都有較好的DNA結(jié)合能力,并且PEI-nHAT在上述濃度范圍內(nèi)均能良好地保護(hù)DNA不被DNase I消化。2)各組動(dòng)物在轉(zhuǎn)染前及轉(zhuǎn)染后48小時(shí)在1kHz、4kHz、8kHz、12kHz及16kHz處短純音誘發(fā)的ABR閾值無(wú)明顯變化,各頻率DPOAE平均幅值差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)�；蜣D(zhuǎn)染48小時(shí)后,各組動(dòng)物耳蝸內(nèi)、外毛細(xì)胞、血管紋上皮及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,排列整齊,未見(jiàn)明顯破壞現(xiàn)象；轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物在耳蝸基底膜的外柱細(xì)胞區(qū)域、部分血管紋上皮細(xì)胞、螺旋神經(jīng)管內(nèi)的部分細(xì)胞中出現(xiàn)綠色熒光表達(dá),但轉(zhuǎn)染率不高。3)各組動(dòng)物術(shù)后48小時(shí)內(nèi)均無(wú)偏頭、步態(tài)不穩(wěn)、強(qiáng)迫環(huán)繞運(yùn)動(dòng)等前庭功能障礙表現(xiàn)。各組動(dòng)物前庭毛細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,無(wú)缺失,纖毛束排列整齊；周圍支持細(xì)胞大小形態(tài)正常。在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組中,濃密的綠色熒光信號(hào)存在于前庭的暗細(xì)胞區(qū)及其過(guò)渡細(xì)胞區(qū),在橢圓囊斑、球囊斑及壺腹嵴的毛細(xì)胞區(qū)域中也出現(xiàn)不同程度的綠色熒光。 結(jié)論：1)PEI-nHAT載體表面帶正電荷,其體外的分散性和穩(wěn)定性良好；2)PEI-nHAT載體在體外能有效結(jié)合和保護(hù)其所攜帶的重組基因質(zhì)粒免受酶化學(xué)物質(zhì)的破壞；3)完整圓窗膜途徑基因轉(zhuǎn)染對(duì)耳蝸的形態(tài)學(xué)及聽力學(xué)功能無(wú)明顯不良影響,該途徑是進(jìn)行耳蝸和前庭局部基因轉(zhuǎn)染的一條安全有效的導(dǎo)入方式；4)前庭暗細(xì)胞是PEI-nHAT載體在內(nèi)耳的一種特異性靶細(xì)胞,它可能具有主動(dòng)攝取PEI-nHAT載體的能力,其原理尚待進(jìn)一步研究；5)PEI-nHAT是一種具有研究?jī)r(jià)值的用于內(nèi)耳基因治療載體的無(wú)機(jī)納米材料。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R764

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本文編號(hào)：2454721