【摘要】：目的：視網(wǎng)膜新生血管(retinal neovascularization, RNV)性疾病是目前主要的致盲眼病,而新生血管的生成依賴于血管內(nèi)皮細(xì)胞的不斷分裂增殖。p21是細(xì)胞周期中重要的負(fù)性調(diào)控因子,主要參與細(xì)胞周期中G1/S期調(diào)控點(diǎn)的調(diào)控,可使細(xì)胞阻滯于G1期,抑制細(xì)胞增殖。本研究通過建立氧誘導(dǎo)RNV小鼠模型并檢測(cè)p21、CDK2及CyclinE mRNA和蛋白在視網(wǎng)膜組織中的表達(dá),探討p21在RNV生成過程中的作用及機(jī)制；進(jìn)而應(yīng)用腺病毒載體將p21基因轉(zhuǎn)染至猴視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞及RNV模型小鼠視網(wǎng)膜組織,觀察其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及RNV的抑制作用及機(jī)制。 方法：(1)選取7日齡C57BL/6J小鼠,共96只,隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組,每組48只。實(shí)驗(yàn)組小鼠按照Smith法建立氧誘導(dǎo)RNV模型,分別于P12、P17、P22時(shí)行熒光視網(wǎng)膜鋪片及組織病理學(xué)檢查評(píng)估兩組小鼠RNV的發(fā)生情況,行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)及蛋白免疫印跡(Western blot. WB)檢測(cè)p21、CDK2及Cyclin E mRNA和蛋白在兩組小鼠視網(wǎng)膜組織中的表達(dá)。(2)體外培養(yǎng)猴微血管內(nèi)皮細(xì)胞(RF/6A),取第3～5代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RF/6A接種到6孔板內(nèi),細(xì)胞同步化后,分為磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution, PBS)組、腺病毒介導(dǎo)p21基因(adenovirus mediated delivery of p21,Ad-p21)組及腺病毒介導(dǎo)空基因(adenovirus mediated delivery of non-target control. Ad-NC)組,分別應(yīng)用PBS、Ad-p21及Ad-NC轉(zhuǎn)染RF/6A,培養(yǎng)48h,行流式細(xì)胞儀、Transwell檢查及成管實(shí)驗(yàn),行RT-PCR及WB檢測(cè)p21、CDK2及Cyclin E mRNA和蛋白在RF/6A中的表達(dá)。(3)選取7日齡C57BL/6J小鼠,共80只,隨機(jī)分為對(duì)照組、PBS組、Ad-p21組及Ad-NC組,每組20只。其中PBS組、Ad-p21組及Ad-NC組小鼠按照Smith法建立氧誘導(dǎo)RNV模型。P11時(shí),非常組不做任何處理,PBS組、Ad-p21組及Ad-NC組玻璃體腔分別注入PBS、Ad-p21及Ad-NC1u1。P17及P22時(shí)行熒光視網(wǎng)膜鋪片及組織病理學(xué)檢查評(píng)估RNV的發(fā)生情況,P17時(shí)行RT-PCR及WB檢測(cè)p21、CDK2及Cyclin E mRNA和蛋白在視網(wǎng)膜組織中的表達(dá)。 結(jié)果：(1)與對(duì)照組比較,P17時(shí)實(shí)驗(yàn)組小鼠熒光視網(wǎng)膜鋪片顯示大面積無灌注區(qū)及熒光素滲漏,視網(wǎng)膜切片可見大量突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核。實(shí)驗(yàn)組小鼠視網(wǎng)膜組織中p21mRNA和蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而CDK2和Cyclin E mRNA及蛋白表達(dá)較對(duì)照組則明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)流示細(xì)胞儀結(jié)果顯示Ad-p21組RF/6A細(xì)胞出現(xiàn)G0/G1期阻滯,G0/G1期細(xì)胞較PBS組及Ad-NC組比例明顯增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Transwell結(jié)果顯示較PBS組和Ad-NC組,Ad-p21組RF/6A細(xì)胞穿膜能力明顯減弱,穿膜細(xì)胞數(shù)較少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。體外成管實(shí)驗(yàn)顯示較PBS組和Ad-NC組,Ad-p21轉(zhuǎn)染組內(nèi)皮細(xì)胞管數(shù)較少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ad-p21組細(xì)胞中p21mRNA和蛋白表達(dá)較PBS組和Ad-NC組明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而CDK2和Cyclin E mRNA及蛋白表達(dá)較PBS組和Ad-NC組則明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(3)Ad-p21組視網(wǎng)膜無灌注區(qū)及新生血管較PBS組和Ad-NC組明顯減少。Ad-p21組視網(wǎng)膜組織p21mRNA及蛋白表達(dá)較其余三組顯著增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而CDK2和Cyclin E mRNA及蛋白表達(dá)較其余三組顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：(1)p21表達(dá)降低可能是視網(wǎng)膜新生血管生成的發(fā)病機(jī)制之一。(2)Ad介導(dǎo)p21通過上調(diào)p21及下調(diào)CDK2、CyclinE的表達(dá),發(fā)揮對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控作用,使RF/6A細(xì)胞停滯于G0/G1期并抑制其增生和遷移。(3)Ad介導(dǎo)p21可通過上調(diào)p21及下調(diào)CDK2、CyclinE的表達(dá),抑制視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂、增生,從而發(fā)揮其抑制視網(wǎng)膜新生血管生成的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R774.1

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本文編號(hào)：2450270