【摘要】：目的觀察HSP47在PVR患者視網(wǎng)膜前增殖膜以及PVR動(dòng)物模型視網(wǎng)膜組織中的表達(dá),推測(cè)HSP47在PVR中可能的作用;通過(guò)觀察慢病毒載體介導(dǎo)的HSP47si RNA對(duì)ARPE-19細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響,明確HSP47在PVR中的作用;觀察LV-HSP47-si RNA對(duì)實(shí)驗(yàn)性PVR疾病進(jìn)程的影響,驗(yàn)證LV-HSP47-si RNA對(duì)PVR的抑制作用。方法1.收集PVRC級(jí)~D級(jí)患者30例,玻璃體切割術(shù)中剝除視網(wǎng)膜前增殖膜,制作病理標(biāo)本;收集同期作為角膜移植的供體眼12例,顯微鏡下剝除其內(nèi)界膜作為對(duì)照。通過(guò)HE染色觀察增殖膜的病理特征,Masson染色觀察增殖膜中膠原蛋白的沉積,免疫組化染色觀察增殖膜和內(nèi)界膜中HSP47以及TGF-β2和I型膠原蛋白的表達(dá)。2.購(gòu)買40只清潔級(jí)健康成年青紫藍(lán)兔,參照文獻(xiàn)方法建立PVR動(dòng)物模型,均以右眼作為實(shí)驗(yàn)眼,左眼作為對(duì)照眼,在造模的不同時(shí)間點(diǎn)摘除實(shí)驗(yàn)眼,制作病理標(biāo)本。通過(guò)HE染色觀察PVR模型中視網(wǎng)膜組織的病理特點(diǎn),Masson染色觀察視網(wǎng)膜組織中膠原蛋白的沉積,免疫組化染色觀察視網(wǎng)膜組織中HSP47以及TGF-β2和I型膠原蛋白的表達(dá)。3.體外實(shí)驗(yàn):體外培養(yǎng)的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ARPE-19細(xì)胞,將細(xì)胞隨機(jī)分為5組:⑴未處理組;⑵TGF-β2處理組;⑶TGF-β2處理+LV-HSP47-si RNA轉(zhuǎn)染組;⑷TGF-β2處理+慢病毒空載體轉(zhuǎn)染組;⑸TGF-β2處理+PBS組。其中⑵~⑸組細(xì)胞用TGF-β2預(yù)處理12h,促使細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,再分別給予⑶、⑷、⑸組細(xì)胞10μl LV-HSP47-si RNA、慢病毒空載體和PBS共孵育48h,通過(guò)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率,CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力,RT-PCR檢測(cè)基因沉默效率,通過(guò)熒光定量PCR和western blot檢測(cè)各組細(xì)胞HSP47、α-SMA、FN和I型膠原蛋白的表達(dá)。4.體內(nèi)實(shí)驗(yàn):購(gòu)買36只健康成年青紫藍(lán)兔,隨機(jī)分為3組,每組12只,分別為:⑴LV-HSP47-si RNA轉(zhuǎn)染組;⑵慢病毒空載體轉(zhuǎn)染組;⑶PBS對(duì)照組;均以右眼為實(shí)驗(yàn)眼,建立PVR模型。于造模7d時(shí)分別給予玻璃體腔內(nèi)注射LV-HSP47-si RNA、慢病毒空載體和PBS,劑量均為10μl,觀察造模后不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)眼的臨床特征,通過(guò)HE染色觀察造模7d、14d和28d時(shí)實(shí)驗(yàn)眼的組織病理學(xué)特征,通過(guò)熒光定量PCR和western blot測(cè)定造模28d各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的視網(wǎng)膜組織中HSP47、α-SMA、FN和I型膠原蛋白的表達(dá)。結(jié)果1.PVR患者增殖膜HE染色可見:增殖膜組織中存在類圓形上皮樣細(xì)胞及長(zhǎng)梭形成纖維樣細(xì)胞,附著在膠原豐富的細(xì)胞外基質(zhì)中,散在色素顆粒;Masson染色可見增殖膜內(nèi)膠原蛋白大量聚集;免疫組化染色見增殖膜中HSP47以及TGF-β2和I型膠原蛋白的表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性,且表達(dá)部位均為細(xì)胞漿及細(xì)胞外基質(zhì)。2.青紫藍(lán)兔PVR動(dòng)物模型在造模后逐漸出現(xiàn)玻璃體混濁、較粗的纖維增殖條索和局限性牽拉性視網(wǎng)膜脫離以及漏斗狀視網(wǎng)膜脫離,造模成功率可達(dá)100%。造模后,青紫藍(lán)兔PVR模型視網(wǎng)膜組織的病理學(xué)特征為:HE染色可見視網(wǎng)膜表面有炎細(xì)胞聚集,成纖維細(xì)胞增生,逐漸出現(xiàn)視網(wǎng)膜表面增殖條索,視網(wǎng)膜水腫、皺褶及牽拉性視網(wǎng)膜脫離,細(xì)胞層次結(jié)構(gòu)紊亂不清,纖維結(jié)締組織增多;實(shí)驗(yàn)性PVR各期均可見視網(wǎng)膜表面存在膠原蛋白增多;免疫組化染色可見HSP47以及TGF-β2和I型膠原蛋白的表達(dá)隨病程延續(xù)逐漸增強(qiáng);正常對(duì)照組兔眼玻璃體呈透明膠凍樣,視網(wǎng)膜各層組織結(jié)構(gòu)完整,免疫組化染色可見TGF-β2、HSP47和I型膠原蛋白均存在弱陽(yáng)性基礎(chǔ)表達(dá)。3.體外實(shí)驗(yàn):⑴5ng/ml TGF-β2處理體外培養(yǎng)的ARPE-19細(xì)胞后,細(xì)胞間質(zhì)標(biāo)記物α-SMA、FN和I型膠原蛋白m RNA和蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào),與未處理組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.05)。⑵細(xì)胞轉(zhuǎn)染LV-HSP47-si RNA實(shí)驗(yàn)結(jié)果示:培養(yǎng)基中聚凝胺(polybrene)的終濃度為5μg/ml,感染復(fù)數(shù)(MOI)為10時(shí),轉(zhuǎn)染效率最高(75%);轉(zhuǎn)染后LV-HSP47-si RNA組和慢病毒空載體組的細(xì)胞活力與PBS組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),說(shuō)明轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞沒(méi)有明顯的毒性;細(xì)胞轉(zhuǎn)染LV-HSP47-si RNA后,通過(guò)RT-PCR檢測(cè)HSP47 m RNA的表達(dá)顯著下調(diào),與慢病毒空載體組和PBS組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),敲除效率可以達(dá)到75%以上。⑶通過(guò)熒光定量PCR和western blot測(cè)定HSP47、α-SMA、FN和I型膠原蛋白m RNA和蛋白的表達(dá)水平,結(jié)果顯示:細(xì)胞轉(zhuǎn)染LV-HSP47-si RNA后,對(duì)于TGF-β2誘導(dǎo)的HSP47、α-SMA、FN和I型膠原蛋白m RNA和蛋白的表達(dá)上調(diào),均有顯著的抑制作用,與慢病毒空載體組和PBS組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.05)。4.體內(nèi)實(shí)驗(yàn):⑴建模后不同時(shí)間點(diǎn)的眼底彩照和B超示:慢病毒空載體組和PBS組病程和病情進(jìn)展相似,逐漸出現(xiàn)玻璃體混濁和粗大的增殖條索、局限性牽拉性視網(wǎng)膜脫離和漏斗狀視網(wǎng)膜脫離,LV-HSP47-si RNA組,出現(xiàn)玻璃體混濁及增殖條索后,繼續(xù)發(fā)生明顯進(jìn)展的數(shù)目顯著減少;⑵Fastenberg分級(jí)結(jié)果顯示:造模14d和28d,合并有視網(wǎng)膜脫離的比率LV-HSP47-si RNA組均少于慢病毒空載體組和PBS組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.598,6.143;P=0.016,0.027)。⑶建模28d,熒光定量PCR和western blot測(cè)定各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的視網(wǎng)膜組織中HSP47、α-SMA、FN、I型膠原蛋白m RNA和蛋白的表達(dá)水平,結(jié)果顯示:玻璃體腔注射轉(zhuǎn)染LV-HSP47-si RNA后,實(shí)驗(yàn)眼視網(wǎng)膜組織HSP47、α-SMA、FN和I型膠原蛋白m RNA和蛋白的表達(dá)水平均顯著下調(diào),與慢病毒空載體組和PBS組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.05)。結(jié)論1.HSP47在PVR增殖膜和PVR動(dòng)物模型的視網(wǎng)膜組織中表達(dá)增強(qiáng),且與I型膠原蛋白的表達(dá)部位一致。2.HSP47可能通過(guò)促進(jìn)膠原蛋白合成而參與PVR的病理性瘢痕形成過(guò)程。3.通過(guò)玻璃體腔注射LV-HSP47-si RNA,轉(zhuǎn)染PVR實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,可以顯著抑制PVR的病程,降低牽拉性視網(wǎng)膜脫離的發(fā)生率。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R774.1

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 王建偉;林鐵柱;李世洋;;增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變的治療進(jìn)展[J];國(guó)際眼科雜志;2014年02期

2 段娜;周靈;;增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變的研究進(jìn)展[J];山東醫(yī)藥;2013年42期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 張?bào)?載有姜黃素的生物可降解鞏膜塞對(duì)增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 殷剛;他克莫司抑制兔外傷性增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變的實(shí)驗(yàn)研究[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2013年

2 蔣姣姣;PDGF-α受體反義寡核苷酸防治增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變的實(shí)驗(yàn)研究[D];桂林醫(yī)學(xué)院;2013年

，

本文編號(hào)：2442140