發(fā)布時間：2019-03-17 09:08

【摘要】：目的觀察HSP47在PVR患者視網膜前增殖膜以及PVR動物模型視網膜組織中的表達,推測HSP47在PVR中可能的作用;通過觀察慢病毒載體介導的HSP47si RNA對ARPE-19細胞上皮間質轉化的影響,明確HSP47在PVR中的作用;觀察LV-HSP47-si RNA對實驗性PVR疾病進程的影響,驗證LV-HSP47-si RNA對PVR的抑制作用。方法1.收集PVRC級~D級患者30例,玻璃體切割術中剝除視網膜前增殖膜,制作病理標本;收集同期作為角膜移植的供體眼12例,顯微鏡下剝除其內界膜作為對照。通過HE染色觀察增殖膜的病理特征,Masson染色觀察增殖膜中膠原蛋白的沉積,免疫組化染色觀察增殖膜和內界膜中HSP47以及TGF-β2和I型膠原蛋白的表達。2.購買40只清潔級健康成年青紫藍兔,參照文獻方法建立PVR動物模型,均以右眼作為實驗眼,左眼作為對照眼,在造模的不同時間點摘除實驗眼,制作病理標本。通過HE染色觀察PVR模型中視網膜組織的病理特點,Masson染色觀察視網膜組織中膠原蛋白的沉積,免疫組化染色觀察視網膜組織中HSP47以及TGF-β2和I型膠原蛋白的表達。3.體外實驗:體外培養(yǎng)的處于對數(shù)生長期的ARPE-19細胞,將細胞隨機分為5組:⑴未處理組;⑵TGF-β2處理組;⑶TGF-β2處理+LV-HSP47-si RNA轉染組;⑷TGF-β2處理+慢病毒空載體轉染組;⑸TGF-β2處理+PBS組。其中⑵~⑸組細胞用TGF-β2預處理12h,促使細胞發(fā)生上皮間質轉化,再分別給予⑶、⑷、⑸組細胞10μl LV-HSP47-si RNA、慢病毒空載體和PBS共孵育48h,通過熒光顯微鏡觀察細胞轉染效率,CCK8實驗檢測細胞活力,RT-PCR檢測基因沉默效率,通過熒光定量PCR和western blot檢測各組細胞HSP47、α-SMA、FN和I型膠原蛋白的表達。4.體內實驗:購買36只健康成年青紫藍兔,隨機分為3組,每組12只,分別為:⑴LV-HSP47-si RNA轉染組;⑵慢病毒空載體轉染組;⑶PBS對照組;均以右眼為實驗眼,建立PVR模型。于造模7d時分別給予玻璃體腔內注射LV-HSP47-si RNA、慢病毒空載體和PBS,劑量均為10μl,觀察造模后不同時間點實驗眼的臨床特征,通過HE染色觀察造模7d、14d和28d時實驗眼的組織病理學特征,通過熒光定量PCR和western blot測定造模28d各組實驗動物的視網膜組織中HSP47、α-SMA、FN和I型膠原蛋白的表達。結果1.PVR患者增殖膜HE染色可見:增殖膜組織中存在類圓形上皮樣細胞及長梭形成纖維樣細胞,附著在膠原豐富的細胞外基質中,散在色素顆粒;Masson染色可見增殖膜內膠原蛋白大量聚集;免疫組化染色見增殖膜中HSP47以及TGF-β2和I型膠原蛋白的表達呈強陽性,且表達部位均為細胞漿及細胞外基質。2.青紫藍兔PVR動物模型在造模后逐漸出現(xiàn)玻璃體混濁、較粗的纖維增殖條索和局限性牽拉性視網膜脫離以及漏斗狀視網膜脫離,造模成功率可達100%。造模后,青紫藍兔PVR模型視網膜組織的病理學特征為:HE染色可見視網膜表面有炎細胞聚集,成纖維細胞增生,逐漸出現(xiàn)視網膜表面增殖條索,視網膜水腫、皺褶及牽拉性視網膜脫離,細胞層次結構紊亂不清,纖維結締組織增多;實驗性PVR各期均可見視網膜表面存在膠原蛋白增多;免疫組化染色可見HSP47以及TGF-β2和I型膠原蛋白的表達隨病程延續(xù)逐漸增強;正常對照組兔眼玻璃體呈透明膠凍樣,視網膜各層組織結構完整,免疫組化染色可見TGF-β2、HSP47和I型膠原蛋白均存在弱陽性基礎表達。3.體外實驗:⑴5ng/ml TGF-β2處理體外培養(yǎng)的ARPE-19細胞后,細胞間質標記物α-SMA、FN和I型膠原蛋白m RNA和蛋白的表達水平顯著上調,與未處理組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P均0.05)。⑵細胞轉染LV-HSP47-si RNA實驗結果示:培養(yǎng)基中聚凝胺(polybrene)的終濃度為5μg/ml,感染復數(shù)(MOI)為10時,轉染效率最高(75%);轉染后LV-HSP47-si RNA組和慢病毒空載體組的細胞活力與PBS組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),說明轉染對細胞沒有明顯的毒性;細胞轉染LV-HSP47-si RNA后,通過RT-PCR檢測HSP47 m RNA的表達顯著下調,與慢病毒空載體組和PBS組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),敲除效率可以達到75%以上。⑶通過熒光定量PCR和western blot測定HSP47、α-SMA、FN和I型膠原蛋白m RNA和蛋白的表達水平,結果顯示:細胞轉染LV-HSP47-si RNA后,對于TGF-β2誘導的HSP47、α-SMA、FN和I型膠原蛋白m RNA和蛋白的表達上調,均有顯著的抑制作用,與慢病毒空載體組和PBS組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P均0.05)。4.體內實驗:⑴建模后不同時間點的眼底彩照和B超示:慢病毒空載體組和PBS組病程和病情進展相似,逐漸出現(xiàn)玻璃體混濁和粗大的增殖條索、局限性牽拉性視網膜脫離和漏斗狀視網膜脫離,LV-HSP47-si RNA組,出現(xiàn)玻璃體混濁及增殖條索后,繼續(xù)發(fā)生明顯進展的數(shù)目顯著減少;⑵Fastenberg分級結果顯示:造模14d和28d,合并有視網膜脫離的比率LV-HSP47-si RNA組均少于慢病毒空載體組和PBS組,差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.598,6.143;P=0.016,0.027)。⑶建模28d,熒光定量PCR和western blot測定各組實驗動物的視網膜組織中HSP47、α-SMA、FN、I型膠原蛋白m RNA和蛋白的表達水平,結果顯示:玻璃體腔注射轉染LV-HSP47-si RNA后,實驗眼視網膜組織HSP47、α-SMA、FN和I型膠原蛋白m RNA和蛋白的表達水平均顯著下調,與慢病毒空載體組和PBS組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P均0.05)。結論1.HSP47在PVR增殖膜和PVR動物模型的視網膜組織中表達增強,且與I型膠原蛋白的表達部位一致。2.HSP47可能通過促進膠原蛋白合成而參與PVR的病理性瘢痕形成過程。3.通過玻璃體腔注射LV-HSP47-si RNA,轉染PVR實驗動物,可以顯著抑制PVR的病程,降低牽拉性視網膜脫離的發(fā)生率。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R774.1

【共引文獻】

相關期刊論文 前2條

1 王建偉;林鐵柱;李世洋;;增生性玻璃體視網膜病變的治療進展[J];國際眼科雜志;2014年02期

2 段娜;周靈;;增殖性玻璃體視網膜病變的研究進展[J];山東醫(yī)藥;2013年42期

相關博士學位論文 前1條

1 張筠;載有姜黃素的生物可降解鞏膜塞對增生性玻璃體視網膜病變抑制作用的實驗研究[D];河北醫(yī)科大學;2015年

相關碩士學位論文 前2條

1 殷剛;他克莫司抑制兔外傷性增生性玻璃體視網膜病變的實驗研究[D];昆明醫(yī)科大學;2013年

2 蔣姣姣;PDGF-α受體反義寡核苷酸防治增殖性玻璃體視網膜病變的實驗研究[D];桂林醫(yī)學院;2013年

，

本文編號：2442140