【摘要】：延緩華勒氏變性(slow Wallerian degeneration, Wlds)突變小鼠最早是被發(fā)現(xiàn)可以延緩神經(jīng)元華勒氏變性,后來研究發(fā)現(xiàn)Wlds基因產(chǎn)物是一種融合蛋白,包括N端70個氨基酸組成的泛素化組裝因子(ubiquitination assembly factor, Ube4b),C端合成NAD的關(guān)鍵酶煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶(nicotinamide mononucleotide adenylyl transferasel, Nmnatl),以及中間18個氨基酸的連接蛋白。研究證實該種基因突變小鼠的神經(jīng)保護功能主要是由Nmnatl介導(dǎo)的,由于是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD)合成的關(guān)鍵酶,因此,一些學(xué)者推測NAD可能參與神經(jīng)變性,并開始進行實驗研究NAD對神經(jīng)的保護作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)NAD與神經(jīng)損傷密切相關(guān)。 糖尿病(diabetes mellitus, DM)是最常見的慢性病之一。隨著人們生活水平的提高,人口老齡化以及肥胖發(fā)生率的增加,糖尿病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病常見的嚴(yán)重并發(fā)癥之一,是導(dǎo)致視力下降的主要原因。糖尿病引起視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機理主要是山梨醇旁路活性的增加以及微血管的病變。近期一些研究表明在組織學(xué)出現(xiàn)血管異常之前已經(jīng)有視網(wǎng)膜組織代謝功能的損害。當(dāng)血糖含量增高,山梨醇途徑明顯激活,代謝過程中,會消耗NAD,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)NAD及NAD/NADH比值下降。同時,最近研究表明糖尿病患者的視網(wǎng)膜活性氧增多導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷,DNA修復(fù)酶聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase, PARP)被明顯激活,進一步導(dǎo)致NAD的耗竭,NAD/NADH降低,從而阻礙細(xì)胞內(nèi)ATP生成,能量代謝紊亂,以及與NAD相關(guān)的靶蛋白的功能異常,最終引起細(xì)胞死亡,視功能下降。 因此,本文工作應(yīng)用Wlds突變小鼠,在建立Ⅰ型糖尿病視網(wǎng)膜病變模型的基礎(chǔ)上,觀察Wlds可否通過改善NAD/NADH比值延緩糖尿病對視網(wǎng)膜功能和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活的損害,為糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生機制積累學(xué)術(shù)基礎(chǔ),同時為印證Wlds基因的神經(jīng)保護機制提供理論依據(jù),并為治療人類眼科相關(guān)疾病提供新的策略。 目的：研究W1ds基因?qū)τ谔悄虿∫暰W(wǎng)膜病變的影響。 方法：實驗動物選取C57BL/6J和Wlds雄性小鼠,4周齡鑒定基因型,1)Ⅰ型糖尿病模型的建立：小鼠8-10周齡時稱量體重,以150mg/Kg劑量空腹腹腔注射鏈脲霉素STZ,單次大劑量損傷胰島B細(xì)胞,未造模對照組腹腔注射檸檬酸鈉緩沖液,隔周監(jiān)測注藥后小鼠空腹血糖、體重以及存活率,血糖11.2mmol/L即認(rèn)為造模成功。小鼠分為四組,分別為C57BL/6J小鼠(wt),STZ誘導(dǎo)的糖尿病C57BL/6J小鼠(wt+stz), Wlds小鼠(Wlds)和STZ誘導(dǎo)糖尿病Wl ds小鼠(Wlds+stz):2)圖形視網(wǎng)膜電圖(Pattern-Electroretinogram, pERG)檢測：pERG檢測四組小鼠的視網(wǎng)膜功能；3)病理學(xué)石蠟切片HE染色對四組小鼠的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(retinal gonglion cell layer, RGCL)細(xì)胞進行形態(tài)學(xué)和細(xì)胞全層計數(shù)定量評價；4)免疫組織化學(xué)：運用活性神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal gonglion cell, RGC)特異性標(biāo)志物微管蛋白(Neuronal Class III p-Tubulin, TUJ-1),統(tǒng)計有活性神經(jīng)節(jié)細(xì)胞在各組的數(shù)量； 5) NAD/NADH匕值測定：分別測定四組小鼠視網(wǎng)膜中NAD/NADH匕值。 結(jié)果：1)C57BL/6J和Wlds小鼠在空腹腹腔注射STZ后均出現(xiàn)空腹血糖值明顯升高,體重下降,造模兩組小鼠血糖及體重相較無明顯差異,但Wlds相對于C57BL/6J小鼠的生存率高；2)生理狀態(tài)下C57BL/6J和Wlds小鼠的pERG、視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞數(shù)量、RGC數(shù)量以及NAD/NADH均無明顯差異；3)pERG檢測：Wlds+stz組小鼠相對于wt+stz組p50的波峰值降低幅度較小,提示wt+stz組視網(wǎng)膜神經(jīng)傳導(dǎo)功能明顯受損；4)組織學(xué)檢測：與對照組相比,STZ造模后wt小鼠神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞數(shù)量以及有活性的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量顯著減少,而WldS小鼠無明顯改變。5)同Wlds+stz組小鼠相比,wt+stz組小鼠視網(wǎng)膜NAD/NADH比值下降更為顯著。 結(jié)論：Wlds相對于C57BL/6J小鼠對糖尿病視網(wǎng)膜病變具有較強的保護性作用,其作用機制可能是通過上調(diào)Wlds蛋白產(chǎn)物NAD合成酶Nmnatl,緩解糖尿病視網(wǎng)膜NAD下降,延緩NAD及NAD/NADH相關(guān)的細(xì)胞生化代謝反應(yīng)和細(xì)胞內(nèi)能量耗竭,對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞起到保護作用,穩(wěn)定視功能,從而對糖尿病視網(wǎng)膜病變起到保護性作用。 綜上所述,本研究工作的創(chuàng)新之處在于： 應(yīng)用Wlds小鼠和C57BL/6J小鼠,研究Wlds在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的作用,獲得Wlds發(fā)揮神經(jīng)保護作用的直接證據(jù)；研究結(jié)果提示W(wǎng)1ds可能通過調(diào)節(jié)糖尿病視網(wǎng)膜細(xì)胞NAD/NADH比值,穩(wěn)定細(xì)胞能量代謝,調(diào)節(jié)NAD相關(guān)作用元件,減少視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的死亡,參與視網(wǎng)膜的保護,為糖尿病視網(wǎng)膜的治療提供新的學(xué)術(shù)研究方向。
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【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R774.1;R587.2

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Expression of hypoxia-inducible factor la and vascular endothelial growth factor in hepatocellular carcinoma: Impact on neovascularization and survival[J];World Journal of Gastroenterology;2005年11期

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本文編號：2424161