【摘要】：下咽癌是頭頸腫瘤中較少見(jiàn)的惡性腫瘤之一。臨床癥狀主要表現(xiàn)為咽部不適、吞咽困難、吞咽疼痛、頸部腫塊和聲音嘶啞等。下咽癌約占頭頸腫瘤3-5%,約占全身腫瘤的0.5%。對(duì)于世界不同的地區(qū)、不同的年齡、不同的性別之間,下咽癌的發(fā)病率均有一定程度的差異。已有的資料顯示歐洲發(fā)病率呈上升的趨勢(shì),在中國(guó)下咽癌的發(fā)病率近年來(lái)卻趨于平緩。同其他惡性腫瘤一樣,下咽癌的病因復(fù)雜,但具體病因尚不明確,下咽癌可能與煙酒有密切的關(guān)系。臨床資料表明,大多數(shù)病人有吸煙飲酒史而且日用量很大,有的持續(xù)時(shí)間相當(dāng)長(zhǎng)。其他因素如營(yíng)養(yǎng)缺乏、環(huán)境污染及病毒感染可能參與其發(fā)病過(guò)程。 下咽癌治療的目標(biāo)當(dāng)前是徹底根除腫瘤,最大限度地減少并發(fā)癥,優(yōu)化生活質(zhì)量,延長(zhǎng)生命。手術(shù)加放化療的綜合治療是公認(rèn)的主要治療手段。雖然放化療手術(shù)及其他治療手段有長(zhǎng)足的發(fā)展,但由于下咽癌臨床診斷多處于晚期階段,而且由于解剖的的特點(diǎn),復(fù)合病變多見(jiàn)。作為頭頸腫瘤中惡性程度很高的腫瘤之一,下咽癌復(fù)發(fā)率高,國(guó)外報(bào)道5年的生存率只有30%。因此早期診斷,加強(qiáng)術(shù)后的復(fù)發(fā)的監(jiān)控,有著十分重要的臨床意義。雖然下咽癌的發(fā)病機(jī)制至今仍不明確,科學(xué)工作者及臨床腫瘤學(xué)家越來(lái)越關(guān)注腫瘤的基因及生長(zhǎng)因子在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程的作用,由此可以探查腫瘤發(fā)生的原因,提高腫瘤的早期診斷率,提高生活質(zhì)量,并改善預(yù)后。綜上,我們對(duì)下咽癌術(shù)后病人復(fù)發(fā)相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行研究,以期為臨床的治療提供一些啟迪。 有絲分裂的動(dòng)力是在動(dòng)粒蛋白和微管之間產(chǎn)生,有絲分裂監(jiān)測(cè)點(diǎn)的信號(hào)通路就在動(dòng)粒蛋白上進(jìn)行。動(dòng)力蛋白既是有絲分裂基本活動(dòng)所必需,又能使染色體的分裂時(shí)產(chǎn)生的差錯(cuò)得以糾正。細(xì)胞分裂,姊妹染色體分離,子細(xì)胞必須得到數(shù)目準(zhǔn)確和結(jié)構(gòu)功能完整的染色體。染色體的不等分會(huì)導(dǎo)致非整倍體的產(chǎn)生,其后果可能是致命性,也可引起先天發(fā)育不良,甚至可導(dǎo)致惡性腫瘤的產(chǎn)生。 動(dòng)力蛋白分為功能性的和結(jié)構(gòu)性的蛋白。作為功能性的蛋白-CENP-H是動(dòng)力蛋白復(fù)合體的重要組成部分,1991年在鼠中首先發(fā)現(xiàn),分子量為33kDa,擁有環(huán)-環(huán)樣的結(jié)構(gòu),除心臟,腦組織,腎上腺以外的組織中均有表達(dá),而且增殖旺盛的器官表達(dá)相對(duì)增強(qiáng)。CENP-H具有重要的生理功能,研究表明CENP-H與CENP-A和CENP-C形成動(dòng)力蛋白復(fù)合體,在有絲分裂中CENP-H是蛋白復(fù)合體不可缺少的一部分。在Hela細(xì)胞中CENP-H被沉默以后可導(dǎo)致CENP-C的減少,預(yù)示著CENP-H在復(fù)合體中的確是發(fā)揮著重要的作用。進(jìn)一步研究表明CENP-H與腫瘤發(fā)生有一定關(guān)系。CENP-H在口腔癌、直腸癌中高表達(dá),促進(jìn)惡性腫瘤的形成。有趣的是CENP-H的高表達(dá)在直腸癌中可誘導(dǎo)多倍體的產(chǎn)生。提示CENP-H在直腸癌形成發(fā)展演進(jìn)中扮演著重要角色。近來(lái)研究還表明CENP-H高表達(dá)是食道癌、非小細(xì)胞肺癌、鼻咽癌預(yù)后的指標(biāo)。 Ki67是核增殖抗原,是研究細(xì)胞增殖的重要指標(biāo),其主要的特點(diǎn)是除G0以外細(xì)胞的各個(gè)期均有表達(dá),Ki67表達(dá)增強(qiáng)預(yù)示細(xì)胞增殖活躍。在臨床及研究領(lǐng)域內(nèi)己廣泛的應(yīng)用,尤其是乳腺癌及前列腺癌。研究表明,Ki67在口腔癌中過(guò)度表達(dá)并可能成為其預(yù)后的指標(biāo)。 綜合上述,雖然CENP-H及Ki67在一些癌中作為預(yù)后的指標(biāo),然而CENP-H及Ki67蛋白在下咽癌中與其預(yù)后的相關(guān)性至今尚無(wú)研究。我們要對(duì)兩因子在下咽癌中的表達(dá)及臨床的關(guān)系進(jìn)行探討。特別是二者的表達(dá)在下咽癌術(shù)后病人復(fù)發(fā)的關(guān)系進(jìn)行深入的研究。另在體外沉默CENP-H以后,檢測(cè)細(xì)胞的增殖、凋亡及侵襲功能,探討CENP-H對(duì)下咽癌的影響。 第一部分CENP-H及Ki67蛋白在下咽癌中的表達(dá) 目的： 1.通過(guò)免疫組化在下咽癌術(shù)后病人的癌組織及癌旁正常黏膜組織行CENP-H的蛋白水平表達(dá)檢測(cè),對(duì)癌組織行Ki67檢測(cè)。進(jìn)一步探討兩個(gè)因子表達(dá)與臨床相關(guān)指標(biāo)如年齡、性別、組織的分化程度、臨床階段、飲酒與非飲酒之間關(guān)系。 2.在下咽癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁正常黏膜中,通過(guò)RT-PCR檢測(cè)CENP-H在下咽癌中的mRNA水平的表達(dá)。 材料及方法： 1.從2003年3月至2005年3月在齊魯醫(yī)院耳鼻喉科住院的首次接受下咽癌手術(shù)治療的病人標(biāo)本中選出112例符合標(biāo)準(zhǔn)者為研究對(duì)象,與每一位病人簽知情同意書(shū)；免疫組化法檢測(cè)CENP-H及Ki67二因子在下咽癌中的蛋白水平表達(dá),對(duì)CENP-H設(shè)癌旁正常黏膜對(duì)照。CENP-H及Ki67二因子在下咽癌中的表達(dá)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：0(無(wú)表達(dá))；1+(淺染色或細(xì)胞著色數(shù)目小于20%)；2+(中等染色或細(xì)胞著色數(shù)目20%-50%)；3+(深染色或細(xì)胞著色數(shù)目大于50%)。0,+是低表達(dá),2+、3+是高表達(dá)。 2.8位下咽癌病人術(shù)后的癌組織及癌旁正常黏膜,Trizol方法制備提取總RNA, CENP-H上游引物是5'-TGCAAGAAAAGCAAATCGAA-3',下游引物是5'-ATCCC-AAGATTCCTGCTGTG-3;內(nèi)參GAPDH上游引物是5'-ACC AC AGTCC ATGCC ATC-AC-3',下游引物是5'-TCCACCACCCTGTGGCTGTA-3'.利用RT-PCR方法檢測(cè)CENP-H的mRNA水平的表達(dá)并定量分析。 結(jié)果： 1.在112下咽癌中CENP-H高表達(dá)者50例(44.6%),低表達(dá)者62例(55.4%)；在黏膜中的高表達(dá)11例(9%)。兩者的陽(yáng)性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05).在112下咽癌中Ki67高表達(dá)者69例(61.6%),低表達(dá)者43例(38.4%)。 2. CENP-H高表達(dá)與病變的晚期階段、飲酒呈密切相關(guān)(P=0.012及P=0.048)。Ki67高表達(dá)與晚期階段密切相關(guān)。Ki67與晚期階段具有相關(guān)性(P=0.021) 3.復(fù)合Ki67及CENP-H在下咽癌中表達(dá)四種的表現(xiàn)：Ki67高表達(dá)/CENP-H高表達(dá)(n=38),Ki67高表達(dá)/CENP-H D低表達(dá)(n=31)ki67低表達(dá)/CENP-H高表達(dá)(n=12)Ki67低表達(dá)/CENP-H低表達(dá)(n=31)。CENP-H與Ki67表達(dá)在下咽癌中具有正相關(guān)(P=0.005Pearson[卡方檢驗(yàn)]；P=0.006[Fisher's檢驗(yàn)])。 4.8例下咽癌病人中顯示CENP-H mRNA水平在下咽癌中高表達(dá),但在癌旁正常粘膜組織中低表達(dá)。 結(jié)論： 1. CENP-H與Ki67在下咽癌中高表達(dá)與臨床階段關(guān)系密切。 2.在下咽癌中CENP-H與Ki67表達(dá)具有正相關(guān)。 第二部分CENP-H與Ki67在下咽癌中的表達(dá)與下咽癌術(shù)后復(fù)發(fā)的系 目的：前期研究表明CENP-H或Ki67在下咽癌中的高表達(dá)與臨床晚期階段密切相關(guān),我們進(jìn)一步研究二者是否作為復(fù)發(fā)的指標(biāo)。 方法： 對(duì)112例下咽癌的病人及病人家屬進(jìn)行面對(duì)面的術(shù)后隨訪。在隨訪中,對(duì)病人進(jìn)行電子喉鏡及CT檢查,并且與病人及／或家屬談話超過(guò)15分鐘,記錄病人術(shù)后的情況。平均隨訪時(shí)間48.5個(gè)月(2-74月)。然后用Kaplan-Meier制作出生存曲線并分析其術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系。Cox分析二者的表達(dá)是否為下咽癌術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。 結(jié)果： 1. CENP-H與Ki67的表達(dá)與下咽癌術(shù)后復(fù)發(fā)差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為P0.001和P=0.009) 2. CENP-H與Ki67的高表達(dá)成為下咽癌術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素(分別為P=0.001和p=0.018)。 結(jié)論： 1.我們的研究結(jié)果顯示,CENP-H與Ki67的表達(dá)增強(qiáng)是下咽癌術(shù)后復(fù)發(fā)一個(gè)標(biāo)志。 2. CENP-H與Ki67可能是下咽癌術(shù)后復(fù)發(fā)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素。 第三部分在FaDu細(xì)胞系中沉默CENP-H對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲的影響 目的：在FaDu細(xì)胞系中,探討沉默CENP-H中對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲的影響。細(xì)胞增殖是通過(guò)CCK8實(shí)驗(yàn)加以檢測(cè),流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡,侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力。 方法： 1. FaDu細(xì)胞系(ATCC)于RPMI1640培養(yǎng)基加上10%胎牛血清(FBS)在37℃5%CO2增濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每3天進(jìn)行傳代。當(dāng)細(xì)胞愈合率達(dá)40-70%進(jìn)行轉(zhuǎn)染。 2.在FaDu細(xì)胞系中沉默CENP-H48小時(shí)后Western Blot檢測(cè)沉默的效率。流式細(xì)胞儀檢測(cè)CENP-H沉默后FaDu細(xì)胞系的凋亡。 3.CCK8檢測(cè)CENP-H沉默后的FaDu細(xì)胞系的增殖情況。 4.侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默CENP-H對(duì)FaDu細(xì)胞的侵襲能力的影響。 結(jié)果： 1.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的效率約60-80%,Western Blot檢測(cè)沉默的效果,CENP-H沉默組與PBS組及陰性對(duì)照組比較,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染沉默的效果好。 2.沉默CENP-H之后,PBS組、陰性對(duì)照組及沉默組細(xì)胞凋亡數(shù)分別為12.18%±2.12%,14.38%±3.12%49.17%±7.78%,它們之間的差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。 3.沉默組、陰性對(duì)照組以及未處理組的吸光值在48小時(shí),72小時(shí)分別是0.312±0.031、0.528±0.025、0.531±0.029和0.512±0.041、0.822±0.064、0.823±0.053。沉默CENP-H后,沉默組、陰性對(duì)照組以及未處理組48,72小時(shí)后細(xì)胞的增殖明顯受影響,三組比較具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。 4.細(xì)胞進(jìn)入小室的細(xì)胞數(shù)沉默組與對(duì)照組分別是每個(gè)高倍視野45±6.45和50±8.73。沉默CENP-H后,對(duì)細(xì)胞的侵襲能力影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論： 1. CENP-H在體外對(duì)細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 2. CENP-H在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)不能增加下咽癌的侵襲能力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R739.63

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2422983