【摘要】：第一部hi PSCs誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜祖細(xì)胞初探目的:探討人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(human induced pluripotent stem cells,hi PSCs)高效分化為視網(wǎng)膜祖細(xì)胞(retinal progenitor cells,RPCs)(hi PSC-RPC)方法,為將來治療視網(wǎng)膜變性疾病提供種子細(xì)胞。方法:細(xì)胞免疫熒光染色法對(duì)hi PSCs特異標(biāo)記物Oct4、SSEA4、Sox2、Nanog和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)進(jìn)行hi PSCs鑒定。在hi PSCs培養(yǎng)基中添加分化誘導(dǎo)劑(Dkk-1、Noggin、Lefty A和IGF-1)誘導(dǎo)分化為hi PSC-RPC。分化后的細(xì)胞分別用q PCR、免疫熒光染色和免疫蛋白印跡方法鑒定其標(biāo)志性基因和蛋白(Pax6、Lhx2、Chx10和Nestin)的表達(dá)。結(jié)果:hi PSCs標(biāo)記物Oct4、SSEA4、Sox2、Nanog和AP陽性表達(dá)。誘導(dǎo)定向分化后的hi PSC-RPC陽性表達(dá)Pax6、Lhx2、Chx10基因,而Oct4基因表達(dá)降低。通過免疫熒光染色鑒定RPCs陽性表達(dá)眼轉(zhuǎn)錄因子(Lhx2、Pax6)和RPCs的特異性標(biāo)記物(Chx10、Nestin)。免疫蛋白印跡分析顯示hi PSCs分化后Oct4蛋白表達(dá)降低,Lhx2蛋白表達(dá)升高。與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:hi PSCs在特定的誘導(dǎo)因子作用下可分化為RPCs。第二部分hi PSC-RPE細(xì)胞對(duì)變性視網(wǎng)膜的保護(hù)研究目的:視網(wǎng)膜色素變性是以感光細(xì)胞進(jìn)行不可逆變性死亡為特征的遺傳致盲性眼疾病。細(xì)胞移植治療是目前實(shí)驗(yàn)研究治療視網(wǎng)膜變性疾病的主要方法之一。hi PSCs源性的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigmented epithelium,RPE)(hi PSCRPE)為致盲性視網(wǎng)膜變性疾病的治療提供種子細(xì)胞。本論文探究hi PSC-RPE細(xì)胞在體外對(duì)神經(jīng)視網(wǎng)膜細(xì)胞作用以及hi PSC-RPE細(xì)胞視網(wǎng)膜下腔移植到視網(wǎng)膜色素變性模型rd10小鼠的影響作用。方法:1.hi PSCs培養(yǎng)液中添加特定的小分子[IGF-1、Noggin、DKK-1、Nicotinamide(NIC)、b FGF、Activin A和SU5402]進(jìn)行循序定向誘導(dǎo)分化為RPE。細(xì)胞免疫熒光染色法鑒定對(duì)分化成hi PSC-RPE細(xì)胞。2.Tranwell小室共培養(yǎng)系統(tǒng)研究hi PSC-RPE細(xì)胞對(duì)鼠神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(mouse retina ganglion cell,m RGC)的增殖和凋亡影響。3.TUNEL染色觀察rd10小鼠視網(wǎng)膜組織片與hi PSC-RPE培養(yǎng)1天后凋亡的感光細(xì)胞。4.球形培養(yǎng)PKH26標(biāo)記的hi PSC-RPE細(xì)胞3天后,用胰酶消化成單散細(xì)胞,接著將hi PSC-RPE(1x104/eye)細(xì)胞移植到出生后12天(postnatal day12,P12)的rd10小鼠視網(wǎng)膜下腔。5.視網(wǎng)膜切片觀察移植的細(xì)胞是否存活,并用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)探測hi PSC-RPE細(xì)胞移植后rd10小鼠眼內(nèi)分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子水平。6.免疫組織化學(xué)、TUNEL檢測和免疫蛋白印跡方法分析移植hi PSC-RPE細(xì)胞對(duì)rd10小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)環(huán)境的影響。7.視網(wǎng)膜電圖(electroretinography,ERG)和視網(wǎng)膜外核層(outer nuclear layer,ONL)厚度分析移植hi PSC-RPE細(xì)胞對(duì)rd10視網(wǎng)膜的結(jié)構(gòu)和功能。結(jié)果:1.hi PSCs通過循序定向誘導(dǎo)20天后可分化hi PSC-RPE,hi PSC-RPE細(xì)胞通過細(xì)胞免疫熒光染色檢測陽性表達(dá)(RPE-65、CRALB、Mitf、Otx2和Tyrosinase)RPE標(biāo)志性蛋白。2.分別用CCK-8法檢測和流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)m RGC與hi PSC-RPE共培養(yǎng)后可促進(jìn)m RGC增殖和降低凋亡,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.TUNEL染色標(biāo)記發(fā)現(xiàn)與hi PSC-RPE細(xì)胞培養(yǎng)可以減少rd10視網(wǎng)膜組織片細(xì)胞的凋亡,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.通過β-半乳糖苷酶(β-Gal)的衰老測試及鈣黃綠素和Eth D-III雙染色測試球形培養(yǎng)后的hi PSC-RPE細(xì)胞可以維持較年輕狀態(tài)和較高的活力。5.通過視網(wǎng)膜組織切片染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植2周后的hi PSC-RPE細(xì)胞在rd10小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)存活。ELISA檢測hi PSCRPE細(xì)胞移植后rd10眼內(nèi)含1.4ug/ml人源色素上皮衍生因子。6.免疫組織化學(xué)方法分析視網(wǎng)膜下腔移植hi PSC-RPE細(xì)胞抑制rd10視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞的激活(CD68)。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示hi PSC-RPE治療的rd10可減少視網(wǎng)膜的凋亡蛋白因子(Bax)。TUNEL檢測分析移植hi PSC-RPE細(xì)胞可以減少rd10感光細(xì)胞的死亡。與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)7.視網(wǎng)膜組織切片和DAPI染色觀察移植hi PSC-RPE細(xì)胞rd10外核層的衰退可以延緩。根據(jù)rd10小鼠在暗適應(yīng)和明適應(yīng)的ERG反應(yīng),hi PSC-RPE移植的視網(wǎng)膜變性rd10小鼠可以提高視力。與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:在我們研究中,hi PSCs可誘導(dǎo)分化成RPE,hi PSC-RPE移植到rd10視網(wǎng)膜下腔,移植細(xì)胞可以存活并且抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活動(dòng),減少相關(guān)凋亡因子,提高改善變性視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R774.1

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本文編號(hào)：2416041