【摘要】：目的觀察由人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,h UCMSCs)體外誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)經(jīng)玻璃體腔途徑移植到糖尿病大鼠眼內(nèi)后,視網(wǎng)膜內(nèi)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)表達(dá)的變化和胸腺肽-1(thymosin-1,Thy-1)陽性表達(dá)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells,RGCs)的變化情況,探討璃體腔移植h UCMSCs誘導(dǎo)的NSCs在糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)的可能神經(jīng)保護(hù)作用,為DR的臨床防治提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。方法采用神經(jīng)分化培養(yǎng)基體外誘導(dǎo)h UCMSCs向NSCs定向轉(zhuǎn)化,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。免疫熒光染色檢測NSCs標(biāo)志物巢蛋白和神經(jīng)源性分化因子1(neurogenic differentiation factor1,Neuro D1)表達(dá)情況。成年雄性斯普拉格-杜勒(Sprague-Dawley,SD)大鼠52只,采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組(A組)和糖尿病組。鏈尿佐菌素(streptozotocin,STZ)腹腔注射制作糖尿病大鼠模型。造模后1個月,將糖尿病組大鼠隨機(jī)分為DR對照組(B組),玻璃體腔注射h UCMSCs組(C組),玻璃體腔注射h UCMSCs誘導(dǎo)的NSCs組(D組)。各組均為13只大鼠。干預(yù)后2、4、6、8周,免疫組織化學(xué)染色觀察視網(wǎng)膜BDNF及Thy-1陽性染色情況,Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析視網(wǎng)膜陽性染色區(qū)的平均累積光密度值(integrated optic density,IOD),并對Thy-1陽性染色的RGCs計(jì)數(shù)。SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.h UCMSCs在神經(jīng)培養(yǎng)基誘導(dǎo)3天時,60-70%細(xì)胞開始聚集形成大小不等的細(xì)胞簇,隨著培養(yǎng)時間的增加,逐漸形成懸浮的細(xì)胞團(tuán)并增大、增多。2.免疫熒光染色示20天時誘導(dǎo)的h UCMSCs高表達(dá)NSCs的特異性標(biāo)志巢蛋白和Neuro D1,陽性細(xì)胞表達(dá)量分別占87.3%和72.6%。3.糖尿病大鼠成模38只,成模率97.43%。本實(shí)驗(yàn)共有26只大鼠行玻璃體腔注射,其中2只大鼠發(fā)生玻璃體腔出血,最終各組大鼠均為12只納入研究。4.免疫組織化學(xué)染色示:(1)BDNF:A組大鼠視網(wǎng)膜BDNF表達(dá)陽性,各層均有表達(dá)。B組呈弱陽性表達(dá),隨干預(yù)后時間延長,染色強(qiáng)度呈減弱趨勢。C組、D組染色強(qiáng)度隨干預(yù)后時間延長而增強(qiáng),D組染色較同期B組、C組更深。B組BDNF表達(dá)隨時間逐漸減少,C組、D組BDNF表達(dá)隨時間逐漸增加,D組更為明顯,組內(nèi)各時間點(diǎn)間比較差異均有顯著性(F=20.325、13.540、16.896,P=0.000)。除干預(yù)后2周時C組較B組BDNF表達(dá)無明顯變化,余各時間點(diǎn)各組間BDNF表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=37.144、27.419、83.659、89.654,P=0.000)。(2)Thy-1:A組Thy-1呈陽性表達(dá),主要表達(dá)于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(ganglioncelllayer,GCL)和內(nèi)叢狀層(inner plexiform layer,IPL)層。B組染色強(qiáng)度明顯減弱,且隨干預(yù)后時間延長染色強(qiáng)度逐漸降低。C、D組隨干預(yù)后時間延長其染色深度逐漸增強(qiáng),D組染色更深。B組Thy-1表達(dá)隨時間逐漸減少,C組、D組Thy-1表達(dá)隨時間逐漸增加,D組更為明顯,除B組、D組干預(yù)后6周較8周Thy-1表達(dá)無明顯改變,余組內(nèi)各時間點(diǎn)間比較差異均有顯著性(F=16.087、15.239、10.950,P=0.000)。除干預(yù)后2周時C組較B組Thy-1表達(dá)無明顯變化,余各時間點(diǎn)各組間Thy-1表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=26.463、51.360、61.820、101.597,P=0.000)。(3)RGCs計(jì)數(shù):A組大鼠視網(wǎng)膜Thy-1陽性RGCs數(shù)目每高倍鏡視野(×400)約33個,B組RGCs數(shù)隨時間逐漸減少,C組、D組隨時間RGCs數(shù)逐漸增多,D組大鼠更為明顯,但均低于同期A組的大鼠RGCs數(shù)目,組內(nèi)不同時間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.273、17.606、16.290,P=0.000)。除干預(yù)后2周C組較B組RGCs無明顯差異,B組、C組、D組余各時間點(diǎn)各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=100.333、117.404、70.212、90.012,P=0.000)。5.BDNF蛋白表達(dá)量與RGCs數(shù)量相關(guān)性分析結(jié)果顯示BDNF的平均IOD值與RGCs數(shù)量呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.964,P=0.000)。結(jié)論1.體外h UCMSCs能夠定向誘導(dǎo)為NSCs,并高表達(dá)NSCs標(biāo)志物巢蛋白和Neuro D1。2.STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠6周時已經(jīng)存在RGCs的丟失。h UCMSCs誘導(dǎo)的NSCs經(jīng)玻璃體腔移植后能夠減少RGCs的丟失。3.h UCMSCs誘導(dǎo)的NSCs經(jīng)玻璃體腔途徑移植到STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠眼內(nèi),能夠促進(jìn)視網(wǎng)膜BDNF的表達(dá)。4.h UCMSCs誘導(dǎo)的NSCs對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的RGCs的保護(hù)作用可能與其促進(jìn)BDNF的表達(dá)有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R587.2;R774.1

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本文編號：2411167