【摘要】：目的:觀察貝伐單抗對人視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細胞抗氧化功能的影響,以探討抗新生血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)制劑治療年齡相關(guān)性黃斑變性后黃斑部萎縮的可能機制。方法:采用人視網(wǎng)膜色素上皮細胞系A(chǔ)RPE-19細胞,培養(yǎng)液中加入終濃度為0.25 g·L-1貝伐單抗,根據(jù)不同的處理時間分為0h組(對照組)、12h組、24h組、48h組、72h組共5組,加入H2O2誘導氧化應激反應。采用CCK-8法檢測細胞活性,用MitoSox Red熒光染色檢測細胞內(nèi)線粒體活性氧(mitochondrialreactive oxygen species,mtROS)產(chǎn)生水平,通過JC-1熒光染色檢測細胞線粒體膜電位的變化;分別用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)及免疫蛋白印跡法(Western blot)檢測促氧化因子NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4,NOX4),抗氧化因子血紅素氧合酶-1(Heme oxygenase-1,HO-1)、NAD(P)H醌氧化還原酶-1(NAD(P)H quinone oxidoreductase,NQO-1)和超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2,SOD2)基因和蛋白的表達水平。結(jié)果:CCK-8檢測結(jié)果顯示:上述處理對細胞活性無顯著影響,0h組、12h組、24h組、48h組和72h組細胞活性分別為(100.2±3.3)%、(99.2±2.7)%,(102.5±6.4)%、(103.9±3.7)%、(103.6±3.3)%,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);細胞內(nèi)線粒體ROS的檢測結(jié)果顯示:與對照組相比,12h、24h、48h、72h組細胞內(nèi)線粒體ROS水平均上升,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);線粒體膜電位檢測結(jié)果顯示:線粒體膜電位在12h、24h、48h、72h組均較對照組降低,差異有顯著性,48h達最低,72h顯著提高,但仍低于對照組;RT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示:與對照組比較,NOX4基因和蛋白的相對表達量在12h、24h、48h和72h組均明顯上升,而且在24h表達最高,之后明顯下降,但仍高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。與對照組比較,HO-1基因的相對表達量在24h、48h和72h組均明顯下降,而HO-1蛋白的表達在48h和72h組均下降,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。與對照組比較,NQO-1基因和蛋白的相對表達量在24h、48h和72h組均明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。與對照組比較,SOD2基因和蛋白的表達在12h、24h、48h和72h組均未見明顯變化,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論:臨床濃度的貝伐單抗可以降低RPE的抗氧化功能,可能是長期抗VEGF治療后黃斑部進行性萎縮的原因之一。
[Abstract]:Objective: to observe the effect of bevacizumab on the antioxidant function of human retinal pigment epithelium (retinal pigment epithelium,RPE) cells and to explore the anti-neovascularization endothelial growth factor (vascular endothelial growth factor,). The possible mechanism of VEGF in the treatment of macular atrophy after age-related macular degeneration. Methods: human retinal pigment epithelial cell line ARPE-19 cells were used. The final concentration of bevacizumab was 0.25 g / L in the culture medium. According to different treatment time, the cells were divided into 0 h group (control group), 12 h group, 24 h group and 48 h group. In 72 h group, 5 groups were added H2O2 to induce oxidative stress reaction. CCK-8 assay was used to detect cell activity, MitoSox Red fluorescence staining was used to detect the level of reactive oxygen species (mitochondrialreactive oxygen species,mtROS) production in mitochondria, and JC-1 fluorescence staining was used to detect the change of mitochondrial membrane potential. Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blot (Western blot) were used to detect the oxidant factor NADPH oxidase 4 (NOX4) and the antioxidant factor heme oxygenase-1 (Heme oxygenase-1,HO-1), respectively. The expression levels of NAD (P) H quinone redox enzyme 1 (NAD (P) H quinone oxidoreductase,NQO-1 and superoxide dismutase 2 (superoxide dismutase 2 so 2) gene and protein. Results: the results of CCK-8 showed that the cell activity was (100.2 鹵3.3)%, (99.2 鹵2.7)%, (102.5 鹵6.4)% in 0 h group, 12 h group, 24 h group, 48 h group and 72 h group, respectively. (103.9 鹵3.7)%, (103.6 鹵3.3)%, the difference was not statistically significant (P0.05); The results of intracellular mitochondrial ROS detection showed that: compared with the control group, the level of mitochondrial ROS increased significantly in 12h / 24h / 48h / 72h group (P0.05). The results of mitochondrial membrane potential detection showed that the mitochondrial membrane potential was significantly lower than that of the control group at 12 h, 24 h, 48 h and 72 h, which was the lowest at 48 h and increased significantly at 72 h, but still lower than that in the control group. The results of RT-PCR and Western blot analysis showed that the relative expression of NOX4 gene and protein increased significantly at 12h, 24h, 48h and 72h, and reached the highest level at 24h, then decreased significantly, but still higher than that of control group. The difference was statistically significant (P0.01). Compared with the control group, the relative expression of HO-1 gene decreased significantly at 24 h, 48 h and 72 h, while the expression of HO-1 protein decreased at 48 h and 72 h, the difference was statistically significant (P0.05). Compared with the control group, the relative expression of NQO-1 gene and protein decreased significantly at 24 h, 48 h and 72 h, the difference was statistically significant (P0.05). Compared with the control group, the expression of SOD2 gene and protein did not change significantly at 12h, 24h, 48h and 72h, the difference was not statistically significant (P0.05). Conclusion: the clinical concentration of bevacizumab can reduce the antioxidant function of RPE, which may be one of the causes of macular progressive atrophy after long term anti VEGF therapy.
【學位授予單位】：青島大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R774

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本文編號：2405995