【摘要】：內(nèi)耳毛細(xì)胞的損傷丟失所導(dǎo)致的耳聾是感音神經(jīng)性聾的主要原因。哺乳類動物內(nèi)耳毛細(xì)胞受損后不具備自我修復(fù)和再生能力,故由毛細(xì)胞變性壞死所引發(fā)的耳聾是不可治愈的。但在某些魚類和兩棲類動物中的毛細(xì)胞損傷丟失后可以繼續(xù)增殖,從而自發(fā)生成新的毛細(xì)胞,可用于毛細(xì)胞再生的研究。斑馬魚因與人類有很高的同源性,發(fā)育周期短等優(yōu)點備受關(guān)注。因胚胎身體透明,方便構(gòu)建各種熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因斑馬魚,用于活細(xì)胞成像觀察(live imaging)這些基因的表達(dá)模式。斑馬魚側(cè)線器毛細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和功能上與哺乳類動物內(nèi)耳毛細(xì)胞類似,且因側(cè)線器位于體表,使得毛細(xì)胞易于被觀察檢測。上述優(yōu)勢使得斑馬魚成為研究毛細(xì)胞發(fā)育及再生的較為理想的模式生物。 側(cè)線系統(tǒng)(lateral line system, LL)作為魚類和兩棲類特有的感覺器官,具有感知水流、水壓和聽覺等功能。它由多個位于體表的神經(jīng)丘(neuromast)細(xì)胞為單位組成。側(cè)線系統(tǒng)根據(jù)分布排列的位置分為前部側(cè)線系統(tǒng)(Anterior lateral line system, ALL)和后部側(cè)線系統(tǒng)(Posterior lateral line system, PLL),前者包括頭部的神經(jīng)丘細(xì)胞,后者包括軀干和尾部的神經(jīng)丘細(xì)胞。側(cè)線神經(jīng)丘細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)單位是由位于神經(jīng)丘中央的毛細(xì)胞(Hair Cell,HC)以及位于周邊的支持細(xì)胞(Supporting Cell,SC)所構(gòu)成。近年來國內(nèi)外學(xué)者對側(cè)線系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)功能及器官發(fā)育等方面均展開了廣泛系統(tǒng)的研究。 組蛋白的乙�；ヒ阴；揎検钦{(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的重要機制之一,在細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及細(xì)胞周期等生物過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。組蛋白的乙�；饕c基因轉(zhuǎn)錄的激活相關(guān),組蛋白的去乙酰化則主要與基因沉默有關(guān)。組蛋白的乙�；揎検怯山M蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferases, HATs)與組蛋白去乙�；D(zhuǎn)移酶(histone deacetylases, HDACs)的動態(tài)平衡來維持的。組蛋白乙�；ヒ阴；揎椩谂咛グl(fā)育、多種器官和系統(tǒng)的形態(tài)發(fā)生等生物學(xué)過程中起著重要作用。近年的研究表明組蛋白去乙酰化修飾與神經(jīng)干細(xì)胞的分化關(guān)系密切,組蛋白去乙�；D(zhuǎn)移酶影響神經(jīng)前體細(xì)胞的分化方向。但關(guān)于乙�；ヒ阴；揎椩诼犛X系統(tǒng)的發(fā)生發(fā)育等一系列生理學(xué)以及病理學(xué)過程中的作用的研究并不多見。 有研究表明組蛋白去乙酰化修飾與內(nèi)耳感覺上皮支持細(xì)胞的分裂增殖有密切關(guān)系。組蛋白去乙�；D(zhuǎn)移酶抑制劑對雞橢圓囊感覺上皮支持細(xì)胞的再生性增殖有抑制作用。然而組蛋白去乙�；揎椩诎唏R魚側(cè)線器早期發(fā)育以及神經(jīng)丘毛細(xì)胞分化過程中發(fā)揮何種作用目前尚不清楚。我們首先以斑馬魚為模型觀察組蛋白去乙�；D(zhuǎn)移酶抑制劑對斑馬魚后部側(cè)線系統(tǒng)發(fā)育的影響。重點研究HDACs在斑馬魚側(cè)線原基的遷徙,神經(jīng)丘的沉積以及側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞的分化這三個過程中的作用,為今后研究魚類后部側(cè)線系統(tǒng)發(fā)育的分子機制提供了一種新的結(jié)合點。最后我們觀察HDACs對哺乳動物內(nèi)耳前體細(xì)胞定向分化的影響,將組蛋白修飾與內(nèi)耳前體細(xì)胞定向分化聯(lián)系起來,為治療感音神經(jīng)性聾提供了一種新的思路。 第一部分組蛋白去乙�；竻⑴c斑馬魚后部側(cè)線原基遷徙以及神經(jīng)丘沉積過程 目的 研究組蛋白去乙�；笇Π唏R魚后部側(cè)線原基(posterior lateral line primordium)遷徙以及神經(jīng)丘沉積的影響。 材料與方法 選擇6hpf的斑馬魚胚胎,分別用不同濃度的組蛋白去乙�；敢种苿┍焖猁}(VPA)、曲古菌素A(TSA)處理胚胎,用DAPI對細(xì)胞核進(jìn)行染色,在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚后部側(cè)線原基的遷徙以及神經(jīng)丘的沉積情況。合成地高辛標(biāo)記的cxcr7b反義RNA探針,進(jìn)行斑馬魚全標(biāo)本包埋的RNA原位雜交,研究cxcr7b mRNA在原基遷移過程中的表達(dá)情況。BrdU標(biāo)記增殖細(xì)胞,觀察原基細(xì)胞團(tuán)的增殖情況。使用蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)方法檢測斑馬魚整體胚胎組蛋白H3和H4的乙酰化水平。 結(jié)果 1.VPA的處理對斑馬魚胚胎的形態(tài)、存活率、孵出率以及行為學(xué)等方面均有影響。表現(xiàn)為隨著藥物濃度增加,身體畸形率增高、胚胎的孵出率和存活率均下降,高濃度VPA (200μM)處理6hpf胚胎持續(xù)至3dpf時,死亡率高達(dá)20%,藥物持續(xù)處理至5dpf時,胚胎基本全部死亡。VPA處理組亦有明顯的行為學(xué)改變,表現(xiàn)為以頭部為軸的風(fēng)車式轉(zhuǎn)動以及異常的逃脫反應(yīng)。蛋白質(zhì)印跡檢測表明VPA處理組的AceH3和AceH4蛋白水平增高； 2.VPA和TSA處理6hpf斑馬魚胚胎,發(fā)現(xiàn)藥物干擾后部側(cè)線系統(tǒng)(PLL)的早期發(fā)育,表現(xiàn)為延緩原基遷徙速度,且呈濃度依賴性。cxcr7b的原位雜交結(jié)果進(jìn)一步證實了該作用； 3.VPA和TSA處理組的側(cè)線神經(jīng)丘的空間分布異常,表現(xiàn)為處理組較對照組神經(jīng)丘所沉積的肌節(jié)位置滯后,尤其是軀干部第一個側(cè)線神經(jīng)丘(L1)的沉積位置顯著延后,且與藥物濃度呈正相關(guān)； 4.免疫熒光染色分析原基細(xì)胞的增殖情況,結(jié)果顯示VPA和TSA處理組的原基細(xì)胞團(tuán)BrdU陽性細(xì)胞數(shù)目較對照組明顯減少。 結(jié)論 1.VPA的處理對斑馬魚胚胎的形態(tài),存活率、孵出率以及行為學(xué)等方面均有影響； 2.組蛋白去乙酰化酶抑制劑的處理延緩斑馬魚后部側(cè)線原基的遷徙速度； 3.組蛋白去乙�；敢种苿┑奶幚碛绊懓唏R魚后部側(cè)線神經(jīng)丘的沉積過程,改變其空間分布； 4.組蛋白去乙�；敢种苿┑奶幚韺υ�(xì)胞團(tuán)有增殖抑制作用。 第二部分組蛋白去乙�；竻⑴c斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞的早期發(fā)育 目的 研究組蛋白去乙�；笇Π唏R魚后部側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞的分化以及神經(jīng)丘細(xì)胞增殖的影響。 材料與方法 選擇3dpf的AB品系以及Brm-GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎,分別用不同濃度的VPA (50,100,150μM), TSA (0.05、0.1、0.2μM)以及MS-275(5,10,15μM)處理胚胎發(fā)育至5dpf或7dpfo以MyosinVI以及GFP標(biāo)記和辨別已分化的毛細(xì)胞,活細(xì)胞染料FM1-43FX標(biāo)記有功能的毛細(xì)胞,BrdU標(biāo)記增殖細(xì)胞,TUNEL和cleaved caspase-3染色標(biāo)記凋亡細(xì)胞,在熒光顯微鏡以及激光共聚焦顯微鏡下觀察藥物處理對神經(jīng)丘細(xì)胞的增殖、凋亡及毛細(xì)胞分化情況的影響。使用免疫熒光染色和蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)方法檢測組蛋白去乙�；敢种苿⿲Π唏R魚胚胎組蛋白H3、H4、H3K9、H3K14、H4K5和H4K12的乙�；降挠绊憽� 結(jié)果 1.組蛋白去乙�；D(zhuǎn)移酶抑制劑的處理致使神經(jīng)丘毛細(xì)胞數(shù)目減少,并呈劑量依賴性關(guān)系。同時使用活細(xì)胞染料FM1-43FX標(biāo)記毛細(xì)胞,結(jié)果表明抑制劑的處理亦導(dǎo)致有功能的毛細(xì)胞數(shù)目減少。免疫熒光染色和Western Blot檢測的結(jié)果均顯示抑制劑處理組的組蛋白H3、H4、H3K9、H3K14H、4K5和H4K12的乙�；缴�。 2.BrdU標(biāo)計增殖細(xì)胞,結(jié)果顯示組蛋白去乙酰化酶抑制劑處理組神經(jīng)丘細(xì)胞團(tuán)中BrdU陽性細(xì)胞數(shù)目明顯減少。TSA (0.1pM)處理組神經(jīng)丘中BrdU陽性細(xì)胞數(shù)為8.2±0.3(n=35),對照組BrdU陽性細(xì)胞數(shù)為11.6±0.3(n=45)(P0.05)。VPA(100μM)處理組神經(jīng)丘中BrdU陽性細(xì)胞數(shù)為8.1±0.3(n=35),對照組BrdU陽性細(xì)胞數(shù)為11.8±0.4(n=46)(P0.05)。MS-275(10μM)處理組神經(jīng)丘中BrdU陽性細(xì)胞數(shù)為6.8±0.3(n=32),對照組BrdU陽性細(xì)胞數(shù)為11.6±0.3(n=45)(P0.05)。 3.高濃度或長時間的TSA處理可誘導(dǎo)神經(jīng)丘細(xì)胞凋亡。神經(jīng)丘細(xì)胞可見TUNEL, cleaved caspase-3陽性染色。 結(jié)論 1.組蛋白去乙酰化酶抑制劑對斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞的分化起抑制作用； 2.組蛋白去乙�；敢种苿⿲Π唏R魚側(cè)線神經(jīng)丘細(xì)胞有增殖抑制作用； 3.組蛋白去乙�；敢种苿┱T導(dǎo)神經(jīng)丘細(xì)胞凋亡呈劑量和時間依賴性。 第三部分組蛋白去乙�；竻⑴c新生小鼠內(nèi)耳前體細(xì)胞的分化 目的 研究組蛋白去乙�；冈谛律∈蠖伕咴鲋城绑w細(xì)胞向感覺上皮尤其是毛細(xì)胞方向分化過程中的作用。 材料與方法 從新生(PO)ICR小鼠聽泡內(nèi)取得耳蝸基底膜組織,經(jīng)酶解消化后,用10%胎牛血清培養(yǎng)液中止消化。離心收集單細(xì)胞懸液,無血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。至第8天時收集懸浮細(xì)胞球進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。實驗組給予TSA(0.1μM)處理,對照組給予DMSO處理,誘導(dǎo)分化1周后去除處理因素,繼續(xù)使用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)1周。收集第8天的懸浮細(xì)胞球和貼壁培養(yǎng)14天的分化細(xì)胞,運用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測神經(jīng)巢蛋白(Nestin)、溴脫氧尿嘧啶(BrdU)、 Pax2, myosin VIIA和Sox2的表達(dá)；運用RT-PCR技術(shù)對內(nèi)耳發(fā)育相關(guān)基因進(jìn)行分析。 結(jié)果 內(nèi)耳前體細(xì)胞向毛細(xì)胞方向分化時,給予TSA處理,結(jié)果觀察到TSA處理組的myosinVIIA與Sox2陽性細(xì)胞數(shù)較對照組均明顯減少。同時檢測前體細(xì)胞的增殖能力,結(jié)果顯示TSA處理組的BrdU陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少,且BrdU和myosinVIIA以及BrdU和Sox2的雙標(biāo)陽性率均顯著低于對照組。RT-PCR結(jié)果亦表明TSA處理組的14天分化細(xì)胞中毛細(xì)胞的標(biāo)志物(Math1、myosinVIIA)以及支持細(xì)胞標(biāo)志物(p27kip1、Sox2)的mRNA表達(dá)水平均低于對照組。 結(jié)論 1.TSA的處理抑制內(nèi)耳前體細(xì)胞向毛細(xì)胞和支持細(xì)胞分化； 2.TSA對細(xì)胞球具有增殖抑制作用。
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【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R764.43

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