【摘要】：第一部分D-半乳糖誘導的SD大鼠擬老化模型的建立目的：建立D-半乳糖誘導的擬老化SD大鼠模型。方法：90只4周齡的SD大鼠,隨機分為兩組,D-半乳糖組(擬老化組)：于頸背部皮下,注射500mg/kg/dD-半乳糖,連續(xù)8周；對照組：等體積0.9%的生理鹽水,頸背部皮下注射,連續(xù)8周。造模結束后,D-半乳糖組和對照組按時間點各分為三個亞組：3月齡組(給藥結束后0個月),9月齡組(給藥結束后6個月)和15月齡組(給藥結束后12個月)。給藥結束后,檢測大鼠聽性腦干反應(Auditory Brainstem Response, ABR);酶標儀檢測總超氧化歧化酶(Total Superoxide Dismutase, T-SOD)和丙二醛(Malondialdehyde termimal, MDA)的水平；實時定量PCR檢測聽皮層線粒體DNA (Mitochondrial DNA, mtDN A)常見缺失突變(Common Deletion, CD)的水平；甲苯胺藍染色法觀察聽皮層神經元細胞密度的變化；透射電鏡觀察聽皮層神經元細胞超微結構的變化;結果：ABR聽力檢測顯示：在相同頻率(4KHz、8kHz、16kHz、24kHz、32kHz),同齡D-半乳糖組和對照組相比,聽力閾值未見顯著性統(tǒng)計學差異(p0.05)。對照組中,在8kHz、16kHz、24kHz、32kHz頻率,15月齡較9月齡,3月齡大鼠聽力閾值增高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。D-半乳糖組中,在4KHz、8kHz、16kHz、 24kHz、32kHz頻率,15月齡較9月齡、3月齡大鼠聽力閾值增高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。與同齡對照組相比,9月齡、15月齡D-半乳糖組大鼠T-SOD水平降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。與同齡對照組相比,3月齡,9月齡,15月齡D-半乳糖組大鼠MDA水平增高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。D-半乳糖組mt DNA CD與同齡對照組相比升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。在對照組中,15月齡大鼠聽皮層mtDNA CD比3月齡以及9月齡大鼠聽皮層mt DNA CD缺失率升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。甲苯胺藍染色法顯示,15月齡D-半乳糖組較其他各年齡組神經元密度下降,差異具有統(tǒng)計學意義,(P0.05)。透射電鏡觀察到D-半乳糖組大鼠比對照組大鼠出現衰老樣超微結構病理變化如細胞核變形、染色質異常分布、線粒體腫脹、脂褐素聚集、神經纖維脫髓鞘樣變等的時間更早,而且這些變化更顯著。結論：隨年齡增長,聽皮層抗氧化酶的活性下降,mtDNA CD蓄積增加,神經元密度降低,神經元細胞結構逐漸出現退行性變,而且D-半乳糖組較對照組這些變化出現的更早,更明顯。長時程、高劑量的D-半乳糖會加速昕皮層細胞的衰老。第二部分Sestrin2蛋白以及自噬在D-半乳糖誘導的擬老化大鼠聽皮層中的作用及作用機制目的：老年性聾是老年人最常見的感覺障礙疾病,它會導致老年人身體、認知、情緒、行為等一系列的功能障礙。目前老年性聾的發(fā)病機制還不清楚。本研究目的是探討自噬,以及自噬相關調控通路蛋白Sestrin2, AMPK以及p70S6K蛋白在D-半乳糖擬老化大鼠聽皮層中的作用。方法：將120只4周齡的SD大鼠,隨機分為兩組給藥：D-半乳糖組(擬老化組)：D-半乳糖500mg/kg/d,頸背部皮下注射,連續(xù)8周；對照組：等體積0.9%生理鹽水,頸背部皮下注射,連續(xù)8周。給藥結束后,D-半乳糖組和對照組按時間點各分為三個亞組：3月齡組(給藥結束后0個月),9月齡組(給藥結束后6個月)和15月齡組(給藥結束后12個月)。酶標儀檢測總超氧化歧化酶(Total Superoxide Dismutase, T-SOD)和丙二醛(Malondialdehyde termimal, MDA)的水平；實時定量PCR檢測聽皮層線粒體DNA (Mitochondrial DNA, mtDNA)常見缺失突變(Common Deletion,CD)的水平。實時定量PCR法檢測beclin 1/Atg6, LC3B/Atg8, Sestrin2 mRNA的表達水平。Westrrn blotting法檢測LC3B, Beclinl, Sestrin2, p-P70S6K, P70S6K, p-AMPK, AMPK的蛋白水平。免疫熒光檢測LC3B在聽皮層的定位表達。結果：9月齡以及15月齡D-半乳糖組大鼠T-SOD水平較同齡對照組降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3月齡,9月齡以及15月齡D-半乳糖組大鼠MDA水平比同齡對照組增高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。D-半乳糖大鼠聽皮層mt DNA CD與同齡對照組相比升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。對照組組內比較,15月齡大鼠聽皮層mtDNA CD比3月齡以及9月齡大鼠聽皮層mt DNA CD升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。RT-PCR結果顯示,與同齡對照組相比,9月齡D-半乳糖組大鼠聽皮層Atg6mRNA表達水平上升1.09倍,P0.05；Atg8mRNA表達水平分別上升0.2和0.27倍,P0.05；Sestrin2 mRNA表達水平分別上升0.33和0.52倍,P0.05。15月齡時,與對照組相比,D-半乳糖組Atg6mRNA、Atg8mRNA、Sestrin2 mRNA表達水平分別下降0.76倍,0.33倍和0.83倍,P0.05。對照組組內比較時,9月齡以及15月齡大鼠較3月齡大鼠聽皮層Atg8mRNA表達水平分別上升0.29和0.21倍,P0.05；Sestrin2 mRNA表達水平分別上升0.62和0.83倍,P0.05。Western blotting結果顯示：與同齡對照組相比,3月齡以及9月齡D-半乳糖組聽皮層Beclin1蛋白水平分別升高0.34,0.52倍,P0.05；LC3 Ⅱ/β-actin比率分別升高0.71和1.21倍,P0.05；Sestrin2蛋白水平分別升高1.03和0.27倍,P0.05；p-AMPK/AMPK比率升高1.57和0.67倍,P0.05, p-p70S6K/p70S6K比率下降1.86和1.21倍,P0.05。15月齡時,與對照組相比,D-半乳糖組大鼠Beclin1蛋白水平下降0.31倍,LC3Ⅱ/β-actin下降0.80倍,Sestrin2蛋白水平下降0.37倍,p-AMPK/AMPK比率下降1.11倍,p-p70S6K/p70S6K比率升高1.89倍,P0.05。在對照組中,9月齡、15月齡較3月齡大鼠LC3Ⅱ/β-actin比率升高0.61和0.37倍,P0.05；Sestrin2蛋白水平升高0.58和0.58倍,P0.05；p-AMPK/AMPK比率升高0.71和1.04倍,P0.05；p-p70S6K/p70S6K比率下降1.63和1.62倍,P0.05。結論：在D-半乳糖誘導的擬老化SD大鼠年齡增長的過程中,自噬水平也在改變,Setrin2-AMPK-p70S6K可能參與年齡相關的自噬活動的調節(jié)。大鼠年輕時,即3月齡以及9月齡時,為了防止氧化應激水平增高以及mtDNA突變增多對細胞的損傷作用,自噬水平升高以維持細胞的穩(wěn)態(tài)。而D-半乳糖大鼠更年長一些,即15月齡時出現與自然衰老機體相似的自噬活動表現,自噬水平明顯下降。而同齡的對照組大鼠,自噬活性未見明顯下降。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R764

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本文編號：2403414