【摘要】：背景與目的 角膜新生血管(corneal neovascularization, CNV)是角膜外傷、感染后最常見的并發(fā)癥,不但嚴(yán)重影響視力,也是角膜移植術(shù)后發(fā)生排斥反應(yīng)的高危因素。血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移與增殖是CNV形成的關(guān)鍵步驟。ADP-核糖基化因子(ADP-ribosylation factor, ARF)是小G蛋白R(shí)as超家族的成員,它們是一類大小約20kDa的鳥嘌呤核苷酸(GTP)結(jié)合蛋白,主要功能是參與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。以往關(guān)于ARF的功能研究主要集中在腫瘤方面,發(fā)現(xiàn)ARF蛋白是腫瘤細(xì)胞增殖和代謝的調(diào)控分子。近來有研究表明ARF在血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移及管腔形成中起重要作用,然而關(guān)于ARF在CNV中的作用及其機(jī)制國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。因此,本課題應(yīng)用小鼠堿燒傷誘導(dǎo)CNV模型并予ARF抑制劑干預(yù),利用角膜鋪片免疫熒光組織化學(xué)法觀察抑制ARF對(duì)堿燒傷誘導(dǎo)CNV的影響,通過RT-PCR法及體外實(shí)驗(yàn)細(xì)胞干預(yù)后行流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率來探討ARF在堿燒傷CNV形成中的作用與機(jī)制。 材料與方法 1、20只BALB/c小鼠做左眼堿燒傷誘導(dǎo)CNV模型,于堿燒傷后0d、7d、14d、21d各時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)取5只小鼠處死,取角膜以RT-PCR法檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)ARF mRNA的表達(dá)情況。 2、21只BALB/c小鼠做左眼堿燒傷誘導(dǎo)CNV模型,于一周后將其隨機(jī)分成25μg/mlARF抑制劑干預(yù)組(11只)和0.2%透明質(zhì)酸鈉(sodium hyaluronate, HA)對(duì)照組(10只)予局部點(diǎn)眼,每日3次,持續(xù)2w。干預(yù)兩周后觀察各組CNV并拍照,處死所有小鼠,取眼球行角膜鋪片以備免疫組織化學(xué)熒光標(biāo)記法檢測(cè)其角膜組織中CD31表達(dá)并對(duì)角膜新生血管面積進(jìn)行比較,分析ARF抑制劑對(duì)堿燒傷CNV的作用。 3、20只BALB/c小鼠堿燒傷一周后將其隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組,每組10只,分別給予25μg/mlARF抑制劑或0.2%HA局部點(diǎn)眼,每日3次。在堿燒傷后2w和3w分別從各組中隨機(jī)取5只小鼠處死,取角膜以RT-CR法檢測(cè)角膜組織中Caspase-3及VEGF mRNA的表達(dá)情況,并比較兩組之間的差異。 4、體外實(shí)驗(yàn)：采用人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human retinal endothelial cells, HRECs)為研究對(duì)象,用含或者不含14μM ARF抑制劑的培養(yǎng)液處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HRECs24h作為實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战M,然后以Annexin V-FITC/PI雙染色法后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。 結(jié)果 1、正常小鼠角膜組織中ARF mRNA微量表達(dá),而堿燒傷后第7d、14d、21d小鼠角膜組織中ARF mRNA表達(dá)明顯增高,于堿燒傷后14d達(dá)高峰。 2、堿燒傷后3w, ARF抑制劑實(shí)驗(yàn)組CNV形成較對(duì)照組明顯減少(P0.05)。 3、堿燒傷后2w、3w,ARF抑制劑實(shí)驗(yàn)組角膜組織中凋亡相關(guān)因子Caspase-3表達(dá)較對(duì)照組明顯增高(P0.05),而VEGF基因表達(dá)較對(duì)照組明顯減少(P0.05)。 4、體外實(shí)驗(yàn)：ARF抑制劑實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組明顯增高(P0.05)。 結(jié)論 1、ARF mRNA在堿燒傷后角膜組織中有表達(dá),于第14d達(dá)高峰。 2、ARF抑制劑能促進(jìn)堿燒傷CNV的退化。 3、ARF抑制劑促進(jìn)堿燒傷CNV的退化,可能與其上調(diào)堿燒傷后角膜組織中凋亡相關(guān)因子Caspase-3和下調(diào)VEGF的表達(dá)有關(guān)。 4、ARF抑制劑促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。
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【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R779.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2378444