【摘要】：糖尿病已經(jīng)成為現(xiàn)代生活中威脅人類健康、影響人們生活的主要疾病，而視網(wǎng)膜新生血管是糖尿病患者致盲的首要原因。糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）典型的臨床體征是動(dòng)脈瘤形成，新生血管形成，玻璃體積血，網(wǎng)膜前增殖膜形成，視網(wǎng)膜脫離等。而在DR早期，視網(wǎng)膜各層血管的周細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞以及Muller細(xì)胞等主要病變是發(fā)生細(xì)胞凋亡。DR的發(fā)病尤其早期病變以神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活、炎癥因子的表達(dá)增加和白細(xì)胞粘附到視網(wǎng)膜的血管壁、神經(jīng)元的凋亡和死亡等病變?yōu)橹鳌Ｄ壳搬槍R的研究熱點(diǎn)是從炎癥、神經(jīng)元細(xì)胞和視網(wǎng)膜血管等病變角度深入開展。關(guān)于DR的成膜方法較多，但普遍都需要比較長的時(shí)間，由于缺血再灌注IR損傷也以上述病變?yōu)橹�，因此我們采用相對快速的IR模型，尋找DR的治療靶點(diǎn)和病理損傷研究及治療的新理念。我們采用IR損傷模型復(fù)制DR的主要病理損傷，用IR來替代DR進(jìn)行某些病理機(jī)制和新治療靶點(diǎn)篩選的研究。 IR是造成視網(wǎng)膜一定時(shí)間的缺血后再去除損傷因素，血流再次返流灌注視網(wǎng)膜血管造成的損傷過程。IR損傷主要由于活性氧自由基和炎癥前因子的改變，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞和血管的損傷。視網(wǎng)膜的IR損傷模型是研究氧自由基和視網(wǎng)膜炎癥的很有價(jià)值的方法，在評價(jià)各種因子對于視網(wǎng)膜損傷的保護(hù)作用也很有價(jià)值。我們分別建立兩種動(dòng)物模型并對比小鼠的IR和DR模型的特征性病理變化，證實(shí)兩種模型在血管和神經(jīng)損傷的病理改變極為相似，因此考慮在一定程度上可以應(yīng)用快速模型IR來復(fù)制DR的病理變化。在IR損傷中，發(fā)現(xiàn)TSP1是早期升高的一個(gè)重要因子，而且TSP1作為內(nèi)源性抑制新生血管的因子被大家熟知。因此我們采用動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)和細(xì)胞體外試驗(yàn)比較WT和TSP1KO在IR模型造成的損害，發(fā)現(xiàn)TSP1可以誘導(dǎo)血管和神經(jīng)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)炎癥發(fā)生、增加氧自由基的損害、白細(xì)胞粘附、破壞血視網(wǎng)膜屏障。結(jié)果可以為評價(jià)TSP1在DR中的作用提供依據(jù)。 1、成功的用腹腔注射STZ方法建立了糖尿病鼠模型。并對病程2-6個(gè)月的小鼠進(jìn)行了針對炎癥因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡、白細(xì)胞粘附功能、血視網(wǎng)膜屏障功能、氧化損傷等病理變化的研究。 我們通過不同劑量組的比較，發(fā)現(xiàn)C57BL6小鼠腹腔注射45mg/Kg的STZ，每天相同時(shí)間連續(xù)注射5天成功建立穩(wěn)定、理想的糖尿病鼠模型。對不同時(shí)期的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞丟失、無核毛細(xì)血管的計(jì)數(shù)、白細(xì)胞粘附和浸潤以及血視網(wǎng)膜屏障功能的測定結(jié)果顯示，這些病變屬慢性過程，隨著病情的進(jìn)展，病理改變逐漸加重。 注射STZ2個(gè)月的小鼠視網(wǎng)膜的TSP1在mRNA水平表達(dá)升高約1倍，說明TSP1在DR的發(fā)病過程中發(fā)揮作用。為了研究TSP1在DR起到什么作用，我們擬采用IR復(fù)制DR病理改變，并用TSP1KO小鼠建立模型進(jìn)行深入研究。 2、成功用前房灌注升高眼壓方法建立缺血再灌注模型。并對模型小鼠進(jìn)行了針對炎癥因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡、白細(xì)胞粘附功能、血視網(wǎng)膜屏障功能、氧化損傷等病理變化的研究，比較在DR模型中的病理變化。發(fā)現(xiàn)二者在上述各方面病理損傷結(jié)局高度相似。并且TSP1在誘導(dǎo)凋亡、炎癥損傷、氧化損傷等過程發(fā)揮了重要作用。 發(fā)現(xiàn)給予小鼠眼球90mmHg的灌注壓，持續(xù)90分鐘的視網(wǎng)膜IR模型穩(wěn)定，并可復(fù)制DR的神經(jīng)細(xì)胞的退變、無核毛細(xì)血管的形成、白細(xì)胞粘附、白細(xì)胞浸潤、血視網(wǎng)膜屏障破壞等損傷性病理改變。視網(wǎng)膜IR模型的炎癥因子和凋亡細(xì)胞明顯增加，認(rèn)為在此過程的炎癥和凋亡機(jī)制發(fā)揮損傷作用。 TSP1敲除小鼠的神經(jīng)細(xì)胞退變、無核毛細(xì)血管形成較對照組明顯減少，而白細(xì)胞粘附和浸潤以及血視網(wǎng)膜屏障較對照組無明顯變化或稍加重。說明TSP1在IR損傷中以促進(jìn)凋亡機(jī)制為主，而在誘導(dǎo)炎癥的過程中的機(jī)制有待深入研究。 確定野生型小鼠IR損傷的一個(gè)重要路徑是通過激活P38路徑、NFκB路徑，進(jìn)而激活CD95L，導(dǎo)致caspase8和caspase3的相繼活化，誘導(dǎo)凋亡產(chǎn)生。 為了進(jìn)一步證明TSP1在視網(wǎng)膜IR模型中的促進(jìn)凋亡作用，我們模擬IR損傷的缺血、缺氧再恢復(fù)供血、供氧的過程，以培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞建立IR的體外模型。發(fā)現(xiàn)應(yīng)用siRNA技術(shù)去除TSP1的表達(dá)，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡減少，并且對于高糖的耐受性較好。 3、我們進(jìn)一步培養(yǎng)HREC細(xì)胞，由于其來源于血管內(nèi)皮，能夠進(jìn)一步證明TSP1對于血管內(nèi)皮的作用。 首先我們建立IR的體外模型，，通過將HREC放入1%的低氧氧箱，再放入正常氧含量的細(xì)胞培養(yǎng)箱。低氧4小時(shí)后，再放于正常氧環(huán)境24小時(shí)，低氧對于細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)為正常氧對照組的3倍，TSP1的蛋白水平也升高到對照組的2倍。說明TSP1在IR誘導(dǎo)后早期表達(dá)即升高，并且可能同時(shí)具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。我們應(yīng)用轉(zhuǎn)染siTSP1細(xì)胞觀察其凋亡變化，發(fā)現(xiàn)沒有TSP1的作用，4小時(shí)低氧后再24小時(shí)正常氧的細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)染siCN組減少了30%，進(jìn)一步證明TSP1在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面有重要的作用。通過對于caspase3的活性測定，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染siTSP1組較對照組凋亡減少35%。證明去除TSP1的作用后，從凋亡前的反應(yīng)到誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生都明顯減少。 高糖誘導(dǎo)HREC，制作DR的體外模型。我們將培養(yǎng)的HREC分成對照組和不同濃度葡萄糖組，發(fā)現(xiàn)隨著血糖升高，caspase3活性相應(yīng)增高，說明高糖可以誘導(dǎo)HREC凋亡。為了研究TSP1在高血糖情況下對于細(xì)胞凋亡的作用，我們應(yīng)用轉(zhuǎn)染siTSP1方法，干涉掉細(xì)胞內(nèi)的TSP1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TSP1KO的高血糖組較TSP1CN對照組細(xì)胞凋亡降低15%，認(rèn)為TSP1對于高糖作用下的細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。 本文通過建立STZ的糖尿病小鼠模型和高眼壓造成的IR模型，比較二者病理變化，發(fā)現(xiàn)DR和IR在病理損傷結(jié)局有較多高度的相似處，而且IR成膜快，認(rèn)為IR可以在尋找DR發(fā)病的機(jī)制，影響因素，治療DR的新靶點(diǎn)等過程中，作為相對快速模型一定程度上替代DR模型。在研究中我們發(fā)現(xiàn)TSP1在IR損傷早期升高，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)TSP1在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、炎癥因子變化、氧化損傷、白細(xì)胞粘附、浸潤、血管通透性方面有很重要的作用。進(jìn)而利用HREC建立IR的體外模型，進(jìn)一步印證了TSP1通過調(diào)節(jié)caspase3活性誘導(dǎo)凋亡，并可以與TNF協(xié)同作用，誘導(dǎo)凋亡和炎癥反應(yīng)。并且，TSP1可以增加高糖狀態(tài)下的HREC凋亡。因此，我們認(rèn)為TSP1可能為DR的機(jī)制研究和治療提供新的思路和方向。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R774.1

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2366353