【摘要】：研究背景和意義視網(wǎng)膜新生血管性疾病是危害視力,致盲的重要疾病之一。目前普遍認(rèn)為視網(wǎng)膜局部缺氧狀態(tài)是誘導(dǎo)視網(wǎng)膜新生血管形成的主要原因之一,其發(fā)病機(jī)制研究是國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。研究證實(shí)缺氧刺激下多種轉(zhuǎn)錄因子活性增加可促進(jìn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞活化,導(dǎo)致新生血管形成,其中除血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)外,特殊蛋白1(SP1)和缺氧誘導(dǎo)因子1-α(HIF1-α)的血管生成作用也逐漸受到關(guān)注。近幾年研究發(fā)現(xiàn),VEGF的啟動子上存在SP1和HIF1-α結(jié)合位點(diǎn),從而可被其調(diào)控引起轉(zhuǎn)錄增強(qiáng);除此之外,課題組研究發(fā)現(xiàn),缺氧誘導(dǎo)下腺苷水平與人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC-1)的活化相關(guān),而SP1和HIF1-α已被證實(shí)可以調(diào)節(jié)腺苷生成的關(guān)鍵核苷酸酶:三磷酸腺苷酶(CD39)和5′核苷酸酶(CD73)。本課題希望通過證實(shí)同時干擾SP1和HIF1-α基因可以較單基因干擾SP1/HIF1α或傳統(tǒng)抗VEGF藥物(雷珠單抗注射液),更能有效抑制人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC-1)活化,從而為進(jìn)一步治療視網(wǎng)膜新生血管性疾病提供新的方法。目的:1、證實(shí)缺氧誘導(dǎo)模型下,HMEC-1細(xì)胞株SP1和HIF1-α表達(dá)水平增高,且通過單因素或雙因素siRNA干擾能成功抑制缺氧下細(xì)胞內(nèi)SP1或/和HIF1-α的表達(dá)。2、證實(shí)聯(lián)合干擾較單因素干擾是否更能有效抑制缺氧誘導(dǎo)下的HMEC-1細(xì)胞株活化效應(yīng)。3、證實(shí)聯(lián)合干擾效應(yīng)是否是通過抑制VEGF促血管內(nèi)皮細(xì)胞活化通路的同時抑制CD39和CD73激活腺苷促血管內(nèi)皮細(xì)胞活化通路而產(chǎn)生。4、證實(shí)聯(lián)合干擾較臨床抗VEGF藥物(雷珠單抗注射液)是否更能有效抑制缺氧誘導(dǎo)下的HMEC-1細(xì)胞株活化效應(yīng)。方法:1、將實(shí)驗(yàn)分為缺氧組(缺氧培養(yǎng)箱:37℃,體積分?jǐn)?shù)1%O2,94%N2和5%CO2)和常氧組(常氧培養(yǎng)箱:37℃,體積分?jǐn)?shù)5%CO2),培養(yǎng)時間分別為12小時和24小時,通過Western blot法檢測缺氧誘導(dǎo)模型下人HMEC-1細(xì)胞株SP1和HIF1-α表達(dá)水平,是否高于常氧狀態(tài);再通過該檢測法驗(yàn)證單因素或聯(lián)合siRNA干擾是否能成功抑制缺氧下HMEC-1細(xì)胞株SP1或/和HIF1-α的表達(dá)。2、將實(shí)驗(yàn)分為缺氧組、常氧組、si RNA-Control組(Control-si)、siRNA-SP1組(SP1-si)、siRNA-HIF1-α組(HIF1-α-si)、siRNA-聯(lián)合干擾組(SP1-si+HIF1-α-si),培養(yǎng)時間為24小時,通過細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK8),EDU法和Transwell法,比較SP1或HIF1-α單因素干擾以及SP1和HIF1-α聯(lián)合干擾對缺氧誘導(dǎo)下的HMEC-1細(xì)胞株活化的抑制效應(yīng)。3、將實(shí)驗(yàn)分為si RNA-Control組、si RNA-SP1組、si RNA-HIF1-α組、si RNA-聯(lián)合干擾組,缺氧下培養(yǎng)24小時,通過Western blot法和免疫熒光法,觀察聯(lián)合干擾對VEGF促血管內(nèi)皮細(xì)胞活化通路的抑制以及CD39和CD73激活腺苷促血管內(nèi)皮細(xì)胞活化通路的抑制作用。4、將實(shí)驗(yàn)分為si RNA-聯(lián)合干擾組、抗VEGF組(0.5mg/ml雷珠單抗注射液),缺氧下培養(yǎng)24小時,通過細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK8),EDU法和Transwell法,比較SP1和HIF1-α聯(lián)合干擾以及傳統(tǒng)抗VEGF藥物(雷珠單抗注射液)對缺氧誘導(dǎo)下的HMEC-1細(xì)胞株活化的抑制效應(yīng)。結(jié)果:1、缺氧模型中,HMEC-1細(xì)胞株SP1和HIF1-α表達(dá)水平高于常氧組,且隨時間增加,表達(dá)量增加;在HMEC-1細(xì)胞株加入SP1或/和HIF1-αsi RNA可有效抑制缺氧下其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。2、缺氧模型中,HMEC-1細(xì)胞株活化效應(yīng)高于常氧組;且對缺氧誘導(dǎo)下的HMEC-1細(xì)胞株活化的抑制效應(yīng),siRNA-聯(lián)合干擾組高于si RNA-SP1組和siRNA-HIF1-α組;3、缺氧模型中,加入SP1或/和HIF1-αsiRNA后,可以有效抑制HMEC-1細(xì)胞株中的VEGF表達(dá),以及CD39、CD73和腺苷的表達(dá),且抑制效應(yīng)si RNA-聯(lián)合干擾組高于si RNA-SP1組和si RNA-HIF1-α組。4、缺氧模型中,siRNA-聯(lián)合干擾組對HMEC-1細(xì)胞株活化效應(yīng)的抑制作用較抗VEGF組(0.5mg/ml雷珠單抗注射液)更明顯。結(jié)論:上述結(jié)果顯示,缺氧誘導(dǎo)下,HMEC-1細(xì)胞株中SP1和HIF1-α表達(dá)水平增高,加入si RNA干擾SP1或/和HIF1-α基因,可通過抑制細(xì)胞中的VEGF表達(dá)以及CD39、CD73和腺苷的表達(dá),使細(xì)胞活化效應(yīng)明顯降低,且聯(lián)合干擾效應(yīng)較單因素干擾效應(yīng)以及傳統(tǒng)抗VEGF(0.5mg/ml雷珠單抗注射液)抑制更明顯。因此我們認(rèn)為,SP1和HIF1-α基因?qū)θ毖鯛顟B(tài)下人微血管內(nèi)皮細(xì)胞活化有重要作用,可進(jìn)一步研究雙靶點(diǎn)干擾效應(yīng),使之成為治療視網(wǎng)膜新生血管性疾病的新治療方式。
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【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R774.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 郎敏;袁容娣;陳春林;霍妍;鄒歡;葉劍;;增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變患者玻璃體腺苷濃度和增殖膜中CD73表達(dá)的研究[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2013年10期

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本文編號：2357604