發(fā)布時間：2018-11-25 19:45

【摘要】：研究背景 鼻咽癌(Nsopharyngeal carcinoma, NPC)是鼻咽上皮源性惡性腫瘤,發(fā)病具有明顯的種族、地域特點,好發(fā)于中國南方諸省(如廣東、廣西、湖南)及香港、臺灣、新加坡華人群體,發(fā)病率為10-50/10萬人/年。而在我國北方地區(qū)與歐美人種中很少發(fā)生。高發(fā)區(qū)人群移居其它地區(qū)后,仍保持高發(fā)病率,并且10%的鼻咽癌患者有癌家族史等,提示遺傳易感性和環(huán)境因素可能在鼻咽癌發(fā)病中起著重要因素。另外,NPC發(fā)病具有性別差異,在被調(diào)查人群中,男女患者比例通常為2-3：1。目前認(rèn)為鼻咽癌是一種多基因遺傳性疾病,涉及多個遺傳易感位點,由遺傳易感因素、EB病毒持續(xù)感染及環(huán)境因素等因素共同作用所致。 MHC (Major histocompatibility complex)位于6p21.3區(qū)域,長約4Mb,占據(jù)0.13%的人基因組(3×109bp),包含150多個基因,占據(jù)30000多個全部已知的蛋白編碼基因的0.5%。許多MHC基因的產(chǎn)物是配體、受體、相互作用的蛋白質(zhì)、信號因子和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,涉及到適應(yīng)性免疫反應(yīng)中部分炎癥反應(yīng)、抗原的加工和遞呈,以及天然免疫中部分NK細(xì)胞和細(xì)胞因子的相互作用。MHC又稱人類白細(xì)胞抗原(HLA)復(fù)合體是目前所知最為復(fù)雜的調(diào)控人體特異性免疫應(yīng)答和決定疾病易感性個體差異的主要基因系統(tǒng)。HLA基因具有高度的多態(tài)性和廣泛的連鎖不平衡性,至今已報道有多種疾病與之相關(guān),如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、川崎病、強(qiáng)直性脊柱炎等等。 白1974年以來,許多研究發(fā)現(xiàn)在HLA復(fù)合體中存在特定的HLA單體型或者基因與鼻咽癌有著潛在的關(guān)聯(lián)。我們之前的meta分析顯示在NPC高發(fā)地區(qū)人群中HLA分布特征不同于低發(fā)地區(qū)的。HLA復(fù)合體無疑在鼻咽癌遺傳易感性中扮演重要角色,或者在調(diào)節(jié)抵抗EB病毒感染的天然和特異性免疫反應(yīng)中有著重要作用,或者只是作為一個與易感位點緊密連鎖的遺傳標(biāo)記。近期,兩個研究組分別對臺灣地區(qū)和華南地區(qū)鼻咽癌人群做了全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome Wide Association Study, GWAS),除了發(fā)現(xiàn)少數(shù)新的易感位點之外,都發(fā)現(xiàn)HLA區(qū)域存在主要的鼻咽癌易感位點。 新一代測序技術(shù)的迅猛發(fā)展,為人們對疾病的認(rèn)識,為疾病的預(yù)防、診斷及治療提供了新的思路。外顯子區(qū)域包含人體蛋白質(zhì)的編碼信息,涵蓋了大部分與個體表型相關(guān)的功能變異。外顯子僅占全基因組的1%,僅對外顯子測序可以更加簡便、經(jīng)濟(jì)、高效,可用于尋找單基因病、復(fù)雜疾病及癌癥等的致病基因和易感基因的研究。用SureSelect靶向富集系統(tǒng),可以只對感興趣的基因區(qū)域進(jìn)行測序,提高工作效率,降低花費,允許每次研究中檢測更多的樣品。同時對樣品DNA量要求降低,使研究者可以使用更多的樣本以滿足統(tǒng)計學(xué)上的要求。 目的 基于MHC是鼻咽癌重要的易感區(qū)域,而人MHC基因組又比較復(fù)雜,我們利用安捷倫SureSelect靶向序列捕獲系統(tǒng),全面精細(xì)地捕獲外顯子和調(diào)控區(qū)域,以期找出功能相關(guān)的SNP位點,為進(jìn)一步尋找鼻咽癌易感基因提供參考。 方法 1.利用靶向捕獲系統(tǒng)結(jié)合高通量測序?qū)HC區(qū)域易感位點初步篩查 (1)在安捷倫eArray網(wǎng)站上設(shè)計探針,并訂制SureSelect靶向捕獲試劑盒。 (2)依照試劑盒說明書處理40例鼻咽癌樣本DNA,然后在新一代高通量測序儀上測序。 (3)將測序結(jié)果與40例來自千人基因組計劃的中國北方漢族人的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對,運用生物信息方法發(fā)現(xiàn)差異SNP。 2.用Sequenom MassArray系統(tǒng)對靶向捕獲測序結(jié)果驗證 (1)第一階段,用310例鼻咽癌病人和310例正常對照對靶向捕獲測序發(fā)現(xiàn)差異的SNP進(jìn)行初步篩選,發(fā)現(xiàn)有顯著性差異的位點。 (2)第二階段,將這些有顯著性意義的位點在另外一個獨立樣本上(768病例和759對照)進(jìn)一步確認(rèn)。 (3)合并兩次驗證的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,最終發(fā)現(xiàn)有顯著性差異的位點。 3.選取其中一個有意義位點進(jìn)行功能初步研究 (1)用生物信息學(xué)軟件,如FastSNP (http://fastsnp.ibms.sinica.edu.tw/pages/input novel.jsp)預(yù)測位點的功能。 (2)提取鼻咽癌細(xì)胞株和鼻咽部組織DNA,用Sequenom MassArray系統(tǒng)結(jié)合測序進(jìn)行SNP分型。 (3)然后用real-time PCR檢測不同分型的細(xì)胞、組織中的基因表達(dá)差異；western blot檢測不同分型之間蛋白質(zhì)表達(dá)差異。 結(jié)果 1.利用靶向捕獲系統(tǒng)結(jié)合高通量測序?qū)HC區(qū)域易感位點初步篩查 靶向捕獲測序和序列比對后發(fā)現(xiàn)了9983個SNP位點存在于MHC區(qū)域的外顯子及調(diào)控區(qū),其中有約187個位點在病例和對照之間存在顯著性差異,由于經(jīng)費的限制我們挑選其中122個有意義的SNP位點進(jìn)行進(jìn)一步驗證,這些位點分布于HLA-A、HLA-B、HLA-DQA1/DQB1、PSORS1C1等基因上 2.用Sequenom MassArray系統(tǒng)對靶向捕獲測序結(jié)果驗證 第一階段對122個測序發(fā)現(xiàn)有差異的SNP進(jìn)行分型,統(tǒng)計分析后有9個SNP具有統(tǒng)計學(xué)差異。第二階段對這9個位點進(jìn)行分型。對第一階段和第二階段分型數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析,發(fā)現(xiàn)chr6_30280350(新位點)、rs1265053、rs1610696、chr6_31190425(新位點)、rs17604492具有顯著性差異,P值分別為6.35E-14,2.61E-15,0.006398,0.006398,0.009038,0.0107；OR值分別為1.902(1.605-2.254),0.6056(0.5347-0.686),0.664(0.4938-0.8928),0.662(0.4341-0.8911),0.7386(0.5849-0.9328),分別落在TRIM26、C6orf15、HLA-G、 PSORS1C1和NOTCH4基因上。 3.Chr6_30280350位點影響TRIM26基因表達(dá)調(diào)控的初步研究 (1)用生物信息學(xué)軟件(FastSNP)預(yù)測結(jié)果顯示：突變型(A)與野生型(T)結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子不同,突變型(A)有4個的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(SRY、MZF1、STATx、C/EBP),而野生型(T)只有一個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(MZF1)。 (2) Real-time PCR檢測結(jié)果顯示,AT位點的鼻咽癌細(xì)胞株C666-1較TT型的細(xì)胞株(CNE1、CNE2、SUNE15-8F、6-10B)中TRIM26的表達(dá)低(F=34.007,P0.001)。 (3)對組織進(jìn)行分型得到9例AA/AT型和25例TT型,real-time PCR得到AA/AT組中TRIM25表達(dá)較TT組中低,t=-3.25,P=0.003。 (4)Western blot檢測不同分型的組織中TRIM26蛋白表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)AA/AT型較TT型蛋白表達(dá)降低。 結(jié)論 1.安捷倫SureSelect靶向捕獲技術(shù)對MHC的捕獲是確實可行的。通過比較得到187個差異性位點,有待于進(jìn)一步驗證。 2.通過兩個階段的驗證,我們發(fā)現(xiàn)了5個鼻咽癌候選易感位點,其中有2個新位點,它們是：TRIM26(chr6_30280350), C6orf15(rs1265053), HLA-G (rs161096), PSORS1C1(chr6_31190425) and NOTCH4(rs17604492). 3.Chr6_30280350位點的突變型位點A有可能降低TRIM26的表達(dá)水平,進(jìn)而增加鼻咽癌易感性。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 潘斌;李偉毅;;HLA多態(tài)性與疾病機(jī)制關(guān)聯(lián)的研究進(jìn)展[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2011年10期

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本文編號：2357193