【摘要】：耳聾和聽力障礙是全球性重大健康問題之一。耳是人類重要的聽覺以及平衡器官,內(nèi)耳毛細胞是聽覺轉(zhuǎn)換的關鍵感覺細胞。當聲波經(jīng)過的時候,毛細胞通過其表面靜纖毛的擺動,將聲波信號轉(zhuǎn)換為電信號,并由神經(jīng)傳給大腦,從而產(chǎn)生聽覺。內(nèi)耳毛細胞的損傷或丟失是誘發(fā)耳聾和聽力喪失的主要原因之一。噪音、衰老、基因突變或藥物濫用(尤其是氨基糖苷類抗生素)都可能會導致內(nèi)耳毛細胞損傷或喪失。在哺乳動物中,包括人類,內(nèi)耳毛細胞一旦遭到破壞,將無法再生,這將導致永久性耳聾。研究耳聾的發(fā)病機理,探索如何在哺乳動物(以至于人類)中再生正常內(nèi)耳毛細胞,這將為治療耳聾或聽力喪失提供幫助。誘導多能干細胞(iPSC)是一類性狀極其類似于胚胎干細胞(ESC)的多能干細胞。規(guī)避倫理問題,分化能力的全能性,無限的擴增能力,獲得病人特異iPSC的能力以及自體移植不存在免疫排斥的效應,這些種種優(yōu)勢都使iPSC在再生醫(yī)學,疾病模型以及藥物篩選等領域擁有廣闊的應用前景。基因編輯技術(shù)的出現(xiàn),尤其是CRISPR/Cas9技術(shù)的快速發(fā)展,使人類能夠隨心所欲的改造或是修正基因。近幾年來內(nèi)耳毛細胞再生研究的突破性進展,使哺乳動物毛細胞再生方法日趨成熟。本研究中,通過iPSC技術(shù),我們建立了致聾基因MY015A突變的iPSC細胞系；通過CRISPR/Cas9技術(shù),我們將MYO15A突變iPSC細胞系中的MYO15A基因進行了修正；通過將iPSC體外誘導分化毛細胞,我們證明了MYO15A的基因校正逆轉(zhuǎn)了由MYO15A突變導致的毛細胞樣細胞的形態(tài)和功能缺陷。第一部分：通過逆轉(zhuǎn)錄病毒,我們將來源于MYO15A突變耳聾病人(MY015A c.4642GA, c.8374GA),病人父親(MYO15A c.8374GA)以及一個聽力正常女孩的成纖維細胞誘導成了iPSC(分別為M-/-iPSC, M+/-iPSC和M+/+iPSC)。三株iPSC都表現(xiàn)出與ESC類似的特性,例如AP陽性,表達多能干細胞特異性標志蛋白OCT4,SOX2, NANOG, SSEA4, TRA-1-60以及TRA-1-81,具有體內(nèi)外三胚層分化的潛能。同時對這三株iPSC的核型進行了檢測,結(jié)果顯示,在經(jīng)過重編程的漫長過程后,三株細胞系都保持了正常的核型。第二部分：通過單層貼壁誘導法,我們將三株iPSC誘導成了聽祖細胞,誘導獲得的聽祖細胞表達聽相關特異性標志蛋白與基因。通過分離聽上皮祖細胞,并與雞胚橢圓囊基質(zhì)細胞共培養(yǎng),我們成功獲得了三株細胞的毛細胞樣細胞。誘導獲得的毛細胞樣細胞表達毛細胞特異標志基因與蛋白,能夠特異攝取FM1-43染料,具有與內(nèi)耳毛細胞類似的鉀電流和鈣電流,并且在這些細胞的表面存在毛細胞特異的靜纖毛樣結(jié)構(gòu)。但同時也觀察到了MY015A突變對M-/-ipSC誘導獲得的毛細胞樣細胞結(jié)構(gòu)和功能的影響。M-/-iPSC誘導獲得的毛細胞樣細胞與M+/+iPSC和M+/-iPSC誘導獲得的毛細胞樣細胞相比表現(xiàn)出肌動蛋白絲結(jié)構(gòu)的紊亂以及顯著縮短的靜纖毛樣結(jié)構(gòu)。第三部分：利用CRISPR-Cas9介導的同源重組技術(shù),我們對M-/-iPSC中MY015A c.4642GA突變位點進行了校正。我們設計并構(gòu)建了打靶載體pX330-maxGFP-sgRNA4,同源重組模板ssODN以及pUC 19-MYO15Asynonymous用于基因校正實驗。通過流式細胞分選以及Sanger測序,我們成功篩選獲得了基因校正的MC/-iPSC細胞系。MC/-iPSC維持正常細胞核型,表達多能干細胞標志基因與蛋白,且具有體內(nèi)外分化的全能性。第四部分：為了了解MYO15A c.4642GA位點的基因校正對M-/-iPSC誘導獲得的毛細胞樣細胞的結(jié)構(gòu)與功能的影響,我們將基因校正的MC/iPSCs誘導聽祖細胞,并進一步誘導為內(nèi)耳毛細胞樣細胞。與M+/+iPSC和M+/-iPSC相似,MC/iPSC分化的聽祖細胞,表達聽相關基因與蛋白,分化的毛細胞樣細胞,表達毛細胞特異性標記基因與蛋白。MC/-iPSC誘導獲得的毛細胞樣細胞具有與M+/+iPSC和M+/iPSC誘導獲得的毛細胞樣細胞相似的電壓依賴電流,具有正常的肌動蛋白絲組織,正常的靜纖毛長度,這與M-/-iPSC誘導獲得的毛細胞樣細胞的表現(xiàn)(肌動蛋白絲結(jié)構(gòu)的紊亂以及顯著縮短的靜纖毛樣結(jié)構(gòu))具有顯著差異。我們的研究表明MY015A的基因校正逆轉(zhuǎn)了由MYO15A突變導致的毛細胞樣細胞的形態(tài)和功能缺陷�？傊�,本研究通過對致聾基因MYO15A突變的iPSC細胞系的基因校正與內(nèi)耳毛細胞的誘導分化成功證明了從人iPSC誘導獲得毛細胞樣細胞的可行性,同時也證明了基因校正能有效逆轉(zhuǎn)MY015A突變導致的毛細胞樣細胞的形態(tài)和功能缺陷。
[Abstract]:Deafness and hearing impairment are one of the major health problems in the world. Ear is the most important auditory and balanced organ of human, and the inner ear hair cell is the key sensory cell of the auditory transition. when the sound wave passes, the hair cell converts the sound wave signal into an electric signal through the swinging of the surface static cilia, and transmits the sound wave signal to the brain, so as to generate the hearing. The damage or loss of hair cells in the inner ear is one of the main causes of deafness and hearing loss. Noise, aging, gene mutations, or drug abuse, in particular, aminosugars and antibiotics, may result in damage or loss of the inner ear hair cells. In mammals, including humans, the inner ear hair cells will not be regenerated once they are destroyed, which will lead to permanent deafness. To study the pathogenesis of deafness and to explore how to regenerate the normal inner ear hair cells in a mammal (such as a human), which will help to treat deafness or hearing loss. The induction of pluripotent stem cells (iPSC) is a class of pluripotent stem cells that are very similar to embryonic stem cells (ESCs). To avoid the ethical problem, the ability of differentiation, the ability of the infinite amplification, the ability of obtaining the specific iPSC of the patient and the effect of no immune rejection in the autotransplantation, all these advantages make the iSC have a wide application prospect in the fields of regenerative medicine, disease model and drug screening. The emergence of gene editing technology, in particular the rapid development of the CRISPR/ Cas9 technology, can make human being able to transform or modify genes as they can. In recent years, the development of the regeneration of hair cells in the inner ear has made the regeneration of the hair cells of the mammalian hair more mature. In this study, we set up an iPSC cell line for the mutation of the deafness gene MY015A through the iPSC technique; through the CRISPR/ Cas9 technique, we corrected the MYO15A gene in the MYO15A mutant iPSC cell line; and by inducing the iPSC in vitro to induce the differentiated hair cell, We demonstrated that the gene correction of MYO15A reversed the morphological and functional deficiencies of the hair cell-like cells resulting from the MYO15A mutation. Part One: By retrovirals, we have induced an iPSC (M-/-iPSC, M +/-iPSC, and M +/ + iPSC, respectively) from the MYO15A mutant deafness patient (MY015A c. 4642GA, c. 8374GA), the patient's father (MYO15A c. 8374GA), and a normal hearing girl. Sanzhu iPSCs exhibit similar characteristics as ESC, such as AP-positive, expression of multipotent stem cell-specific marker proteins OCT4, SOX2, NNOG, SSEA4, TRA-1-60, and TRA-1-81, with the potential for ectodermal differentiation in vivo. At the same time, the karyotype of Sanzhu iPSCs was tested, and the results showed that after the long process of reprogramming, the normal karyotype of Sanzhu cell line was maintained. The second part: Through the single-layer malapposition method, Sanzhu iPSC is induced to be an auditory progenitor cell, and the expression of the obtained auditory progenitor cells is induced to the relevant specific marker protein and gene. We successfully obtained the hair cell-like cells of Sanzhu cells by separating and co-culturing the epithelial progenitor cells and co-culturing with the matrix cells of the chick embryo. The induced hair cell-like cells express the specific marker gene and the protein of the hair cell, can specifically capture the FM1-43 dye, have similar potassium current and calcium current to the hair cell of the inner ear, and have a specific static cilia-like structure on the surface of the cells. However, the effect of the MY015A mutation on the structure and function of the hair cell-like cells induced by M-/-ipSC was also observed. The M-/-iPSC-induced hair cell-like cells exhibited a disorder of the actin filament structure as compared to the hair cell-like cells obtained by the M +/ + iPSC and M +/-iPSC-induced hair cell-like cells, as well as a significantly reduced static cilia-like structure. The third part: Using the homologous recombination technique mediated by CRISPR-Cas9, we corrected the mutation site of MY015A c. 4642GA in M-/-iPSC. We designed and constructed the target vector pX330-maxGFP-sgRNA4, the homologous recombination template ssODN and pUC 19-MYO15Asyncymous for gene correction experiments. By flow cytometry and Sanger sequencing, we successfully screened the MC/-iPSC cell line that obtained the gene correction. The MC/-iPSC maintains the normal cell nucleus type, expresses the multipotent stem cell marker gene and the protein, and has the function of external differentiation in vivo. In the fourth part, in order to understand the effect of gene correction on the structure and function of the hair cell-like cells induced by M-/-iPSC, the gene-corrected MC/ iPSCs were induced to the progenitor cells and further induced to the inner ear hair cell-like cells. Similar to M +/ + iPSC and M +/-iPSC, the MC/ iPSC-differentiated auditory progenitor cells express the related genes and proteins, differentiated hair cell-like cells, and express hair cell-specific marker genes and proteins. The MC/-iPSC-induced hair cell-like cells had a similar voltage-dependent current to the hair cell-like cells obtained by the M +/ + iPSC and M +/ iPSC-induced hair cell-like cells, with normal actin filament tissue, normal cilia length, This has a significant difference with the expression of the hair cell-like cells obtained by the M-/-iPSC-induced hair cell-like cells (the disorder of the actin filament structure and the significantly shortened static cilia-like structure). Our study showed that the gene correction of MY015A reversed the morphological and functional defects of hair cell-like cells caused by the mutation of MYO15A. In conclusion, this study successfully demonstrated the feasibility of induction of hair cell-like cells from human iPSC by gene correction of the iPSC cell line that has been mutated to the deafness gene MYO15A and the induction differentiation of the inner ear hair cell. It also proved that the gene correction can effectively reverse the morphological and functional defects of hair cell-like cells caused by the mutation of MY015A.
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R764.43

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本文編號：2349513