【摘要】：目的:通過建立小鼠穿透性角膜移植模型研究自噬(autophagy)-IL-1β信號通路在角膜移植免疫排斥反應(yīng)中的作用。方法:(1)構(gòu)建小鼠穿透性角膜移植模型,并隨機(jī)分為異系角膜移植組、異系角膜移植并雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)納米膠束點眼組、異系角膜移植并3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)點眼組。通過裂隙燈觀察并評估RAPA及3-MA對角膜移植植片生存的影響;通過蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)觀察異系角膜移植組、異系角膜移植并RAPA納米膠束點眼組、異系角膜移植并3-MA點眼組角膜植片的病理改變;于角膜移植術(shù)后2周左右分別從異系移植組、異系移植并RAPA納米膠束點眼組、異系移植并3-MA點眼組中分離小鼠角膜,利用Western Blot分析角膜中自噬相關(guān)蛋白以及白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)表達(dá)水平變化。(2)體外分離骨髓并通過巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Macrophage colony stimulating factor,M-SCF)誘導(dǎo)骨髓源巨噬細(xì)胞(Bone marrow derived macrophages,BMDMs)。在此基礎(chǔ)上,分別用RAPA、3-MA預(yù)處理,然后給予脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)及三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)刺激,然后通過Western Blot分析巨噬細(xì)胞裂解液中自噬相關(guān)蛋白以及IL-1β表達(dá)水平的變化,通過酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測上清中IL-1β的含量。(3)分別利用NLRP3基因缺陷小鼠以及野生型(wild-type,WT)小鼠構(gòu)建穿透性角膜移植模型。在此基礎(chǔ)上,采用臨床觀察等手段評估NLRP3對角膜移植免疫排斥反應(yīng)的影響;在角膜移植術(shù)后2周左右分別從NLRP3缺陷型小鼠及野生型小鼠中分離角膜,利用Western Blot分析角膜中IL-1β的變化;通過HE染色法觀察角膜植片的病理變化;利用實時定量PCR(Real time PCR,RT-PCR)檢測角膜中白細(xì)胞介素-17(interleukin-17,IL-17)的表達(dá)水平。結(jié)果:(1)小鼠角膜移植術(shù)后,異系移植組、RAPA納米膠束點眼組、3-MA點眼組發(fā)生免疫排斥反應(yīng)的平均時間分別為(16.83±1.21)d、(30.00±0.00)d、(12.63±3.42)d,P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。HE染色結(jié)果顯示:與異系移植組相比,3-MA點眼組角膜植片明顯混濁水腫,角膜基質(zhì)中可見大量炎性細(xì)胞浸潤;而RAPA納米膠束點眼組角膜植片不水腫,角膜基質(zhì)中炎性細(xì)胞少。上述結(jié)果提示RAPA可抑制角膜移植免疫排斥反應(yīng),3-MA可促進(jìn)角膜移植免疫排斥反應(yīng)。通過Western Blot發(fā)現(xiàn):與異系移植組相比較,RAPA納米膠束點眼組角膜植片中膜型微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtuble associated protein light chain 3,LC3)-II的表達(dá)量明顯多于胞漿型的自噬相關(guān)蛋白LC3-I(LC3-I),自噬底物p62/SQSTM1蛋白的表達(dá)水平顯著降低,提示RAPA納米膠束點眼可增強(qiáng)角膜植片中的自噬作用;而3-MA點眼組角膜植片中LC3-II型蛋白的表達(dá)水平明顯少于LC3-I型,并且自噬相關(guān)底物p62/SQSTM1蛋白的表達(dá)水平卻明顯增加,提示3-MA點眼可抑制角膜植片中的自噬作用�；谏鲜鼋Y(jié)果,我們推測,RAPA可通過誘導(dǎo)自噬抑制角膜移植免疫排斥反應(yīng),而3-MA抑制自噬則可促進(jìn)角膜移植免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生。此外,我們通過Western Blot還發(fā)現(xiàn):與未治療組相比較,RAPA納米膠束點眼組的角膜植片中成熟形式的IL-1β表達(dá)水平明顯減少,而3-MA點眼組角膜植片中成熟形式的IL-1β的表達(dá)水平卻明顯增多,提示IL-1β可能在角膜移植免疫排斥過程中起關(guān)鍵作用。(2)我們通過BMDM模型發(fā)現(xiàn):在LPS與ATP刺激條件下,經(jīng)RAPA預(yù)處理的細(xì)胞裂解液以及培養(yǎng)上清中成熟形式的IL-1β含量顯著降低,并伴隨自噬相關(guān)底物p62/SQSTM1的表達(dá)水平明顯下降;而經(jīng)3-MA預(yù)處理的細(xì)胞裂解液以及培養(yǎng)上清中成熟形式的IL-1β的含量顯著增加,并伴隨自噬相關(guān)底物p62/SQSTM1的表達(dá)水平的明顯增加。以上結(jié)果從細(xì)胞水平上進(jìn)一步證實:RAPA可通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬抑制IL-1β的成熟,而3-MA則通過抑制自噬可促進(jìn)IL-1β的成熟。(3)NLRP3炎癥小體是介導(dǎo)IL-1β成熟的關(guān)鍵蛋白復(fù)合體,接下來我們通過NLRP3基因缺陷小鼠評估IL-1β對角膜移植免疫排斥反應(yīng)的影響。我們發(fā)現(xiàn):野生型小鼠和NLRP3基因缺陷型小鼠發(fā)生免疫排斥反應(yīng)的平均時間分別為(17.25±5.42)d、(25.50±5.73)d,(P0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。HE染色結(jié)果顯示:野生型小鼠角膜植片明顯水腫,角膜基質(zhì)中可見大量炎性細(xì)胞浸潤,而NLRP3基因缺陷小鼠的角膜植片不水腫,角膜基質(zhì)中炎性細(xì)胞浸潤明顯減少。Real-time PCR的結(jié)果表明:與野生型小鼠相比較,NLRP3基因缺陷小鼠角膜植片中IL-17的表達(dá)水平明顯下降。上述結(jié)果表明NLRP3基因缺陷可延緩角膜移植免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生。同時,Western Blot結(jié)果顯示:與野生型小鼠相比較,NLRP3基因缺陷小鼠角膜植片中IL-1β成熟體的表達(dá)水平明顯減少。而通過結(jié)膜下注射向NLRP3基因缺陷小鼠的角膜植片中回輸IL-1β則可促進(jìn)角膜移植免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生�；谏鲜鼋Y(jié)果,我們提出NLRP3可通過影響IL-1β的成熟參與角膜移植免疫排斥反應(yīng)過程。結(jié)論:1.誘導(dǎo)自噬可以抑制角膜移植免疫排斥反應(yīng),并延長角膜植片存活時間;而抑制自噬則可顯著促進(jìn)角膜移植免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生。2.自噬可通過調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的IL-1β成熟參與角膜移植免疫排斥反應(yīng)的病理過程。
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【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R779.65

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Increase of peripheral Th17 lymphocytes during acute cellular rejection in liver transplant recipients[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2012年06期

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本文編號：2340552