【摘要】：乳轉(zhuǎn)鐵蛋白(lactotransferrin, LTF)屬于轉(zhuǎn)鐵蛋白家族,它是一種具有多種重要生物學(xué)功能的糖蛋白。LTF具有參與鐵代謝、抗菌、抗真菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)和抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種生物學(xué)功能。近年來大量的體內(nèi)外研究顯示LTF具有明顯的抗腫瘤作用。目前關(guān)于LTF對腫瘤細(xì)胞直接的作用的機(jī)制并不清楚。研究發(fā)現(xiàn),LTF能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞G1/S周期阻滯,并且能調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白如p21、p27、Rb,LTF也能誘導(dǎo)某些腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。 我們前期研究利用湖南鼻咽癌高發(fā)家系,通過連鎖分析及單體型分析,發(fā)現(xiàn)染色體3p21為鼻咽癌易感基因區(qū)。而LTF基因正好位于此區(qū)域。前期研究發(fā)現(xiàn)LTF在鼻咽癌中顯著下調(diào)或缺失,且其表達(dá)水平與鼻咽癌的臨床分期、轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后密切相關(guān)。初步功能研究發(fā)現(xiàn),LTF明顯抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖,將細(xì)胞阻滯于Go/G1期,并且LTF抑制MAPK信號傳導(dǎo)通路,下調(diào)cyclin D1、pRb、p21、p27等周期相關(guān)蛋白。有研究報(bào)道,在鼻咽癌組織和細(xì)胞系中LTF基因位點(diǎn)存在雜合性丟失和啟動子區(qū)域的高甲基化。這些證據(jù)提示,LTF在鼻咽癌是一個潛在的抑瘤基因,它在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要的作用。 在本課題中,為了進(jìn)一步闡述LTF抑制鼻咽癌生長轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,以及LTF在鼻咽癌中表達(dá)下調(diào)機(jī)制,我們進(jìn)行了以下研究,并取得了相應(yīng)的結(jié)果： 1.LTF通過抑制MAPK通路下調(diào)PDKl表達(dá),導(dǎo)致AKT活性下調(diào) 首先,我們通過功能獲得和缺失方法證實(shí)了LTF具有抑制鼻咽癌生長轉(zhuǎn)移作用。為了研究LTF基因的抑瘤分子機(jī)制,采用全基因組表達(dá)譜芯片分析及qRT-PCR和Western blot等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),LTF能顯著下調(diào)PDK1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase1,PDPK1or PDK1)的mRNA及蛋白表達(dá)水平。接下來,我們確定LTF能否影響PDK1的轉(zhuǎn)錄活性。我們將PDK1啟動子克隆入熒光素酶報(bào)告載體與LTF表達(dá)質(zhì)�；騆TF shRNA共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)LTF能抑制PDK1的轉(zhuǎn)錄活性。因?yàn)閏-Jun能激活PDK1轉(zhuǎn)錄,而以往的研究顯示LTF能抑制MAPK通路活性和c-Jun的表達(dá)。為了確定LTF抑制PDK1表達(dá)是否與抑制MAPK信號通路和c-Jun的表達(dá)有關(guān),我們分別用P13K抑制劑LY294002、MEK抑制劑PD98059、JNK抑制劑SP600125處理LTF基因封閉的細(xì)胞,觀察PDK1表達(dá)變化情況。我們發(fā)現(xiàn)MAPK抑制劑能拮抗LTF基因封閉細(xì)胞的c-Jun表達(dá),導(dǎo)致PDK1顯著下調(diào),然而P13K抑制劑處理的細(xì)胞,PDK1表達(dá)無明顯變化。這表明MAPK信號通路參與LTF抑制PDK1過程。隨后,我們在LTF基因沉默細(xì)胞中轉(zhuǎn)染c-Jun siRNA證實(shí)了抑制c-Jun表達(dá)確實(shí)能下調(diào)PDK1表達(dá)。這些結(jié)果表明,LTF能通過抑制MAPK活性下調(diào)PDK1的表達(dá)。 AKT是PDK1最經(jīng)典的靶分子,因此我們檢測LTF對AKT通路的影響。我們發(fā)現(xiàn)過表LTF明顯抑制AKT通路激活,而封閉LTF表達(dá)則促進(jìn)AKT通路激活。AKT的充分活化需要PDK1磷酸化其Thr308和mTORC2磷酸化其Ser473。PDK1只負(fù)責(zé)磷酸化AKT蛋白的Thr308,與Ser473的磷酸化無關(guān)。我們意外地發(fā)現(xiàn),AKT Ser473磷酸化被LTF下調(diào)的程度相似于甚至高于LTF下調(diào)Thr308磷酸化的程度。更重要的是,無論是野生型PDK1還是PDK1活性形式(PDK1-A280V)都能拯救LTF對AKT Thr308磷酸化的影響,但是兩者都不能拯救其Ser473的磷酸化(圖1-18)。這些結(jié)果表明,LTF能通過下調(diào)PDK1而抑制AKT活性,并且也提示,LTF還能通過其他的機(jī)制抑制AKT活性。 2.LTF通過與Keratin18相互作用阻止Keratin18與14-3-3蛋白結(jié)合,進(jìn)而阻止Keratin18促進(jìn)AKT通路的激活 為探討LTF抑制AKT活性的新機(jī)制,我們尋找新的LTF交互作用蛋白。通過免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜分析,我們鑒定出3個LTF相互作用蛋白,分別是Keratin18(K18)、Keratin16(K16)、Keratin10(K10)。隨后,通過免疫共沉淀-Western blot證實(shí)LTF與K18存在交互作用。并通過免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn),LTF與K18在細(xì)胞漿內(nèi)存在共定位現(xiàn)象。 K18是細(xì)胞骨架中間絲蛋白中的角蛋白(Keratin)家族成員,新近研究顯示,Keratin家族成員K17能以磷酸化依賴形式與adaptor蛋白14-3-3σ蛋白結(jié)合,K17與其結(jié)合后能作為一個支架蛋白募集信號蛋白激活A(yù)KT并且促進(jìn)上皮細(xì)胞的生長。以往的研究顯示Ser33磷酸化的K18也能與14-3-3蛋白,并且K18與14-3-3蛋白與有絲分裂期14-3-3蛋白在細(xì)胞內(nèi)的重新分布有關(guān)。本研究我們也證實(shí)了K18能以磷酸化依賴形式與14-3-3σ相互作用,與K18結(jié)合是14-3-3蛋白滯留在胞漿內(nèi)所必需的。并且我們也發(fā)現(xiàn),K18能像其家族成員K17一樣通過將14-3-3蛋白滯留在胞漿內(nèi)而激活A(yù)KT通路,從而促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞生長增殖。另外,抑制K18表達(dá)不影響MAPK通路和PDK1的表達(dá),提示LTF抑制MAPK活性及下調(diào)PDK1表達(dá)與K18無關(guān)。 為了明確LTF是否可通過與K18交互作用影響K18與14-3-3蛋白結(jié)合從而影響AKT通路激活,我們在過表達(dá)LTF的鼻咽癌細(xì)胞系中檢測K18與14-3-3蛋白的結(jié)合。結(jié)果顯示,LTF過表達(dá)在不影響K18磷酸化情況下阻止K18與14-3-3結(jié)合。通過免疫熒光發(fā)現(xiàn)過表達(dá)LTF能隔離14-3-3蛋白于胞核內(nèi)。隨后我們發(fā)現(xiàn),LTF過表達(dá)能阻止K18促進(jìn)AKT通路的激活及解除K18促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞生長作用。 3.LTF可通過AKT通路抑制鼻咽癌細(xì)胞生長轉(zhuǎn)移 LTF能通過兩種不同的機(jī)制抑制P13K/AKT通路活性。為了確定LTF抑制鼻咽癌細(xì)胞生長轉(zhuǎn)移的功能是否通過AKT通路途徑實(shí)現(xiàn),我們使用P13K/AKT特異性抑制劑處理LTF基因沉默的鼻咽癌細(xì)胞發(fā)現(xiàn),與未處理的LTF基因沉默細(xì)胞相比,P13K/AKT特異性抑制劑處理的LTF基因沉默細(xì)胞生長速度減慢,軟瓊脂集落形成率減少,細(xì)胞侵襲能力下降。這些結(jié)果表明LTF確實(shí)可通過抑制AKT通路影響鼻咽癌細(xì)胞生長轉(zhuǎn)移。 采用組織芯片通過免疫組化檢測鼻咽癌組織中LTF與AKT磷酸化表達(dá)情況。結(jié)果顯示：與正常鼻咽上皮組織相比,LTF在鼻咽癌組織中表達(dá)明顯下調(diào)；而AKT的磷酸化表達(dá)的則與之相反,與正常鼻咽組織相比,pAKT Thr308及pAKT Ser473在鼻咽癌組織中表達(dá)明顯上調(diào)。在鼻咽癌中LTF與pAKT Thr308和pAKT Ser473呈負(fù)相關(guān)。并且,pAKT Thr308與pAKT Ser473呈正相關(guān)。這進(jìn)一步支持LTF負(fù)調(diào)控AKT通路。 4.miR-214通過靶向抑制LTF影響AKT通路,從而促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞增殖侵襲能力 前期研究中我室多次大樣本量證實(shí),LTF在鼻咽癌中顯著下調(diào)或缺失。為確定LTF在鼻咽癌中下調(diào)是否與miRNA異常有關(guān),我們研究LTF與miRNA關(guān)系。通過在線軟件Targetscan預(yù)測及熒光素酶活性檢測發(fā)現(xiàn),miR-214能特異地與LTF3'UTR結(jié)合。并且miR-214能抑制LTF mRNA及蛋白表達(dá)。這說明miR-214直接靶向調(diào)控LTF。體內(nèi)外研究顯示,miR-214具有促進(jìn)鼻咽癌生長轉(zhuǎn)移的作用。因LTF能抑制AKT活性,所以我們檢測miR-214對AKT通路的影響。結(jié)果顯示,miR-214能促進(jìn)AKT激活,并且過表達(dá)LTF能拮抗miR-214激活A(yù)KT,表明miR-214通過靶向抑制LTF影響AKT通路。接下來我們也通過細(xì)胞生長曲線和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí),miR-214通過靶向抑制LTF,影響AKT通路,促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞增殖侵襲能力。 5.鼻咽癌中LTF低表達(dá)與miR-214高表達(dá)相關(guān) 我們運(yùn)用qRT-PCR在臨床標(biāo)本中檢測miR-214與LTF表達(dá)情況。結(jié)果顯示,與正常鼻咽上皮組織相比,miR-214在鼻咽癌組織表達(dá)普遍上調(diào),并且在有轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織。而LTF在組織中的表達(dá)模式與miR-214正好相反,與正常鼻咽上皮組織相比,LTF在鼻咽癌組織表達(dá)明顯下調(diào),并且在有轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織。通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)鼻咽癌組織中LTF低表達(dá)與miR-214高表達(dá)相關(guān)。 綜上所述,LTF能通過兩種不同機(jī)制抑制AKT通路激活：一是LTF通過抑制MAPK通路下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子c-Jun,而c-Jun是PDK1轉(zhuǎn)錄激活因子,c-Jun下調(diào)導(dǎo)致PDK1表達(dá)下調(diào),最終導(dǎo)致AKT活性下調(diào)；二是LTF通過與K18相互作用阻止K18與14-3-3蛋白結(jié)合,使14-3-3聚積于細(xì)胞核內(nèi),導(dǎo)致AKT活性下調(diào)。而LTF可通過抑制AKT通路發(fā)揮其抑制鼻咽癌生長轉(zhuǎn)移作用。我們通過研究LTF與miRNA關(guān)系發(fā)現(xiàn),鼻咽癌中LTF的表達(dá)受到miR-214的調(diào)控,miR-214通過靶向LTF影響AKT通路,從而促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞生長侵襲能力。鼻咽癌組織中miR-214高表達(dá)是導(dǎo)致LTF低表達(dá)的機(jī)制之一。
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【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2334336