【摘要】：研究背景隨著人口的日益增多及老齡化社會(huì)的到來,白內(nèi)障導(dǎo)致的視力損傷也越來越多,這一問題已嚴(yán)重影響到人們的健康以及生活質(zhì)量。目前白內(nèi)障已成為世界上最主要的致盲性眼病之一,但其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。既往研究發(fā)現(xiàn),白內(nèi)障的發(fā)生是由多種因素相互作用導(dǎo)致的,常見的原因包括晶狀體氧化損傷、老化變性、晶狀體蛋白發(fā)生基因突變、輻射損傷、糖的過度刺激、半乳糖代謝障礙以及脂質(zhì)過氧化損傷等,由于這些因素長(zhǎng)期對(duì)晶狀體的刺激,導(dǎo)致晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cells, LECs)產(chǎn)生不同程度的損傷,最終使晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡,晶狀體從透明轉(zhuǎn)為混濁狀態(tài),從而使其功能受到影響,影響光線通過玻璃體到達(dá)視網(wǎng)膜的通路,最終導(dǎo)致視物不清、視力下降。年齡相關(guān)性白內(nèi)障(age-related cataract, ARC)以往也稱為老年性白內(nèi)障,這是一種與年齡相關(guān)的疾病,也是目前老年人出現(xiàn)視力下降及盲的主要原因。其發(fā)生主要是由于隨著年齡增長(zhǎng),晶狀體受到如上所述一些因素的影響,出現(xiàn)變性混濁。隨著我國(guó)人口的增長(zhǎng)及老齡化,年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者人數(shù)不斷增加。有研究表明,晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡在其發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用。晶狀體赤道部的上皮細(xì)胞不斷增生分化,從而形成新的晶狀體纖維,這些晶狀體纖維不斷向晶狀體的中央?yún)^(qū)即晶狀體核區(qū)移動(dòng),在這個(gè)過程中,晶狀體纖維細(xì)胞的細(xì)胞器和細(xì)胞核不斷地發(fā)生退化,最終消失,只殘留透明的細(xì)胞質(zhì)部分,進(jìn)而形成了晶狀體核,這一部分幾乎是不存在蛋白質(zhì)的,隨著時(shí)間推移,晶狀體的硬度較前增加。隨著年齡增長(zhǎng),老化是不可避免的,人類無法完全阻止各個(gè)器官的老化,包括晶狀體的老化,但隨著科學(xué)的發(fā)展,我們正在努力采取一些措施來延緩晶狀體的老化。對(duì)于年齡相關(guān)性白內(nèi)障,如果能夠及早采用外用藥物干預(yù),預(yù)防晶狀體混濁的發(fā)生,提早實(shí)現(xiàn)維持晶狀體透明,減輕年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)展程度,更大程度地提高年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者的生存質(zhì)量。目前白內(nèi)障的治療方法主要是通過晶狀體超聲乳化或晶狀體囊外摘除術(shù)來摘除混濁的晶狀體,植入人工晶體,使患者視力得到恢復(fù),但這一技術(shù)仍有一定的創(chuàng)傷性；并且傳統(tǒng)治療白內(nèi)障藥物在臨床應(yīng)用上的效果也不十分明顯。因此,對(duì)年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究,將為年齡相關(guān)性白內(nèi)障的治療提供新的思路。研究目的為進(jìn)一步探討年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制,本研究采用miRNA芯片技術(shù)篩選人眼年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞與正常晶狀體上皮細(xì)胞中miRNA的表達(dá)譜,并對(duì)hsa-miRNA-15a調(diào)控晶狀體上皮細(xì)胞凋亡機(jī)制進(jìn)行熒光定量分析及細(xì)胞培養(yǎng)過表達(dá)檢測(cè),進(jìn)一步闡明年齡相關(guān)性白內(nèi)障與晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的關(guān)系,為白內(nèi)障的基因治療奠定基礎(chǔ)。研究方法本研究分為三部分：第一部分miRNA芯片篩選miRNA在年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞及正常晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá)譜,初步篩選出與年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)生相關(guān)的miRNAs表達(dá)譜,為miRNAs參與晶狀體上皮細(xì)胞凋亡行為的機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。本研究采用miRNAs芯片技術(shù),選取5例年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體前囊膜及5例正常晶狀體前囊膜,檢測(cè)兩種晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)miRNAs的表達(dá),篩選出與白內(nèi)障發(fā)生相關(guān)且差異大于2倍的miRNAs。第二部分檢測(cè)hsa-miRNA-15a及其靶基因bcl-2、 mcl-1在年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞及正常晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá),研究hsa-miRNA-15a及其靶基因bcl-2. mcl-1在年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)生過程中的變化,進(jìn)一步闡明其在白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制中的作用。本研究選取60例年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者,包括皮質(zhì)性白內(nèi)障20例、核性白內(nèi)障20例和后囊下型白內(nèi)障20例(分別標(biāo)記為A、B、C組),20例正常晶狀體前囊膜上皮細(xì)胞做為對(duì)照組,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Real-time PCR)方法檢測(cè)hsa-miRNA-15a-5p. hsa-miRNA-15a-3p在對(duì)照組和三種不同類型年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá)；同上述方法,將獲取的晶狀體前囊膜一半用于Real-time PCR,另一半用于Western blot檢測(cè),分別采用這兩種方法檢測(cè)其靶基因bcl-2和mcl-1在對(duì)照組和三種不同類型年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá),并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。第三部分培養(yǎng)人晶狀體上皮細(xì)胞,將hsa-miRNA-15a過表達(dá)于人晶狀體上皮細(xì)胞,檢測(cè)hsa-miRNA-15a對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的影響,從而進(jìn)一步明確其對(duì)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的作用。選取人晶狀體上皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),分別轉(zhuǎn)染hsa-miRNA-15a-5p和hsa-miRNA-15a-3p,采取Real-time PCR驗(yàn)證其在培養(yǎng)人細(xì)胞中的表達(dá)量,電鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變,通過MTS、平板克隆細(xì)胞增殖試驗(yàn),Hoechst、TUNEL、 AnnexinV-FTTC/PI凋亡檢測(cè)及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞功能學(xué)的改變。研究結(jié)果1.通過對(duì)年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞和正常晶狀體細(xì)胞樣品miRNAs芯片表達(dá)譜的結(jié)果分析,以上調(diào)或下調(diào)2倍為基準(zhǔn),通過篩選,其中有181個(gè)miRNAs上調(diào),有114個(gè)miRNAs下調(diào)。在這些miRNAs中,有126個(gè)上調(diào)超過5倍；有51個(gè)下調(diào)超過5倍。2.通過Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：hsa-miRNA-15a-5p、hsa-miRNA-15a-3p、在正常晶狀體上皮細(xì)胞中有少量表達(dá),而在皮質(zhì)性、核性及后囊下型白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞表達(dá)量明顯增高,在皮質(zhì)性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中表達(dá)水平可達(dá)正常晶狀體的5-8倍,在核型白內(nèi)障中達(dá)到10倍以上,在后囊下型白內(nèi)障中甚至可達(dá)20倍以上。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示,hsa-miRNA-15a-5p在皮質(zhì)性白內(nèi)障組、核性白內(nèi)障組、后囊下型白內(nèi)障組中平均相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；hsa-miRNA-15a-3p在皮質(zhì)性白內(nèi)障組、核性白內(nèi)障組、后囊下型白內(nèi)障組中平均相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。Real-time PCR和Western-blot檢測(cè)結(jié)果均顯示：bcl-2和mcl-1在正常晶狀體上皮細(xì)胞中可見表達(dá),而在皮質(zhì)性、核性及后囊下型白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中表達(dá)量明顯下調(diào)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,bcl-2在皮質(zhì)性白內(nèi)障組、核性白內(nèi)障組、后囊下型白內(nèi)障組中平均相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；mcl-1在在皮質(zhì)性白內(nèi)障組、核性白內(nèi)障組、后囊下型白內(nèi)障組中平均相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。3.采用經(jīng)典的Taqman探針方法,對(duì)轉(zhuǎn)染了hsa-miRNA-15a-5p、 hsa-miRNA-15a-3p的人晶狀體上皮細(xì)胞(Human Lens Epithelial, HLE-B3)進(jìn)行了定量分析。結(jié)果顯示在HLE-B3細(xì)胞中未檢測(cè)到hsa-miRNA-15a-5p或hsa-miRNA-15a-3p,可能極低甚至不表達(dá)這兩種miRNA;轉(zhuǎn)染了hsa-miRNA-15a-5p和hsa-miRNA-15a-3p的HLE-B3細(xì)胞中,這兩種miRNA表達(dá)均有顯著提高。細(xì)胞形態(tài)顯示轉(zhuǎn)染了這兩種miRNA的細(xì)胞,從24h就開始發(fā)生改變,細(xì)胞變大變圓,輪廓不清,交織的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)減少。MTS結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了這兩種miRNA之后,其生長(zhǎng)明顯受到抑制。hsa-miRN A-15a-3p對(duì)HLE-B3生長(zhǎng)的最大抑制率達(dá)到57.13%, hsa-miRNA-15a-5p對(duì)HLE-B3生長(zhǎng)的最大抑制率達(dá)到44.60%。平板克隆結(jié)果顯示hsa-miRNA-15a-5p和hsa-miRNA-15a-3p對(duì)HLE-B3細(xì)胞的克隆形成能力也有明顯的抑制作用,TUNEL凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染了這兩種miRNA的HLE-B3細(xì)胞檢測(cè)到明顯的綠色熒光,說明這兩種miRNA誘發(fā)了HLE-B3細(xì)胞的凋亡。Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)染后的HLE-B3細(xì)胞,其細(xì)胞碎片明顯多于對(duì)照組；劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了hsa-miRNA-15a-5p的HLE-B3細(xì)胞的水平遷移能力受到明顯抑制,而轉(zhuǎn)染hsa-miRNA-15a-3p的細(xì)胞沒有影響。結(jié)論1.年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中niRNAs表達(dá)譜與正常晶狀體上皮細(xì)胞表達(dá)譜有差異,差異表達(dá)的miRNAs可能參與了年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)生。2. hsa-miRNA-15a-5p和hsa-miRNA-15a-3p在三種不同類型的年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中表達(dá)均較正常晶狀體上皮細(xì)胞表達(dá)升高；而bcl-2和mcl-1均較正常晶狀體上皮細(xì)胞表達(dá)降低o hsa-miRNA-15a-5p、hsa-miRNA-15a-3p可能通過抑制其靶基因bcl-2和mcl-1的表達(dá)促使細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)生。3.hsa-miRNA-15a-5p和hsa-miRNA-15a-3p轉(zhuǎn)染人晶狀體上皮細(xì)胞后抑制細(xì)胞增殖及克隆,促使晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡,從而啟動(dòng)了年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)生。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R776.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2323360