【摘要】：研究背景隨著人口的日益增多及老齡化社會的到來,白內障導致的視力損傷也越來越多,這一問題已嚴重影響到人們的健康以及生活質量。目前白內障已成為世界上最主要的致盲性眼病之一,但其發(fā)病機制尚不完全清楚。既往研究發(fā)現(xiàn),白內障的發(fā)生是由多種因素相互作用導致的,常見的原因包括晶狀體氧化損傷、老化變性、晶狀體蛋白發(fā)生基因突變、輻射損傷、糖的過度刺激、半乳糖代謝障礙以及脂質過氧化損傷等,由于這些因素長期對晶狀體的刺激,導致晶狀體上皮細胞(lens epithelial cells, LECs)產(chǎn)生不同程度的損傷,最終使晶狀體上皮細胞發(fā)生凋亡,晶狀體從透明轉為混濁狀態(tài),從而使其功能受到影響,影響光線通過玻璃體到達視網(wǎng)膜的通路,最終導致視物不清、視力下降。年齡相關性白內障(age-related cataract, ARC)以往也稱為老年性白內障,這是一種與年齡相關的疾病,也是目前老年人出現(xiàn)視力下降及盲的主要原因。其發(fā)生主要是由于隨著年齡增長,晶狀體受到如上所述一些因素的影響,出現(xiàn)變性混濁。隨著我國人口的增長及老齡化,年齡相關性白內障患者人數(shù)不斷增加。有研究表明,晶狀體上皮細胞的凋亡在其發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用。晶狀體赤道部的上皮細胞不斷增生分化,從而形成新的晶狀體纖維,這些晶狀體纖維不斷向晶狀體的中央?yún)^(qū)即晶狀體核區(qū)移動,在這個過程中,晶狀體纖維細胞的細胞器和細胞核不斷地發(fā)生退化,最終消失,只殘留透明的細胞質部分,進而形成了晶狀體核,這一部分幾乎是不存在蛋白質的,隨著時間推移,晶狀體的硬度較前增加。隨著年齡增長,老化是不可避免的,人類無法完全阻止各個器官的老化,包括晶狀體的老化,但隨著科學的發(fā)展,我們正在努力采取一些措施來延緩晶狀體的老化。對于年齡相關性白內障,如果能夠及早采用外用藥物干預,預防晶狀體混濁的發(fā)生,提早實現(xiàn)維持晶狀體透明,減輕年齡相關性白內障的發(fā)展程度,更大程度地提高年齡相關性白內障患者的生存質量。目前白內障的治療方法主要是通過晶狀體超聲乳化或晶狀體囊外摘除術來摘除混濁的晶狀體,植入人工晶體,使患者視力得到恢復,但這一技術仍有一定的創(chuàng)傷性；并且傳統(tǒng)治療白內障藥物在臨床應用上的效果也不十分明顯。因此,對年齡相關性白內障的發(fā)病機制進行進一步研究,將為年齡相關性白內障的治療提供新的思路。研究目的為進一步探討年齡相關性白內障的發(fā)病機制,本研究采用miRNA芯片技術篩選人眼年齡相關性白內障晶狀體上皮細胞與正常晶狀體上皮細胞中miRNA的表達譜,并對hsa-miRNA-15a調控晶狀體上皮細胞凋亡機制進行熒光定量分析及細胞培養(yǎng)過表達檢測,進一步闡明年齡相關性白內障與晶狀體上皮細胞凋亡的關系,為白內障的基因治療奠定基礎。研究方法本研究分為三部分：第一部分miRNA芯片篩選miRNA在年齡相關性白內障晶狀體上皮細胞及正常晶狀體上皮細胞中的表達譜,初步篩選出與年齡相關性白內障發(fā)生相關的miRNAs表達譜,為miRNAs參與晶狀體上皮細胞凋亡行為的機制提供研究基礎。本研究采用miRNAs芯片技術,選取5例年齡相關性白內障晶狀體前囊膜及5例正常晶狀體前囊膜,檢測兩種晶狀體上皮細胞內miRNAs的表達,篩選出與白內障發(fā)生相關且差異大于2倍的miRNAs。第二部分檢測hsa-miRNA-15a及其靶基因bcl-2、 mcl-1在年齡相關性白內障晶狀體上皮細胞及正常晶狀體上皮細胞中的表達,研究hsa-miRNA-15a及其靶基因bcl-2. mcl-1在年齡相關性白內障發(fā)生過程中的變化,進一步闡明其在白內障發(fā)病機制中的作用。本研究選取60例年齡相關性白內障患者,包括皮質性白內障20例、核性白內障20例和后囊下型白內障20例(分別標記為A、B、C組),20例正常晶狀體前囊膜上皮細胞做為對照組,采用實時熒光定量PCR (Real-time PCR)方法檢測hsa-miRNA-15a-5p. hsa-miRNA-15a-3p在對照組和三種不同類型年齡相關性白內障晶狀體上皮細胞中的表達；同上述方法,將獲取的晶狀體前囊膜一半用于Real-time PCR,另一半用于Western blot檢測,分別采用這兩種方法檢測其靶基因bcl-2和mcl-1在對照組和三種不同類型年齡相關性白內障晶狀體上皮細胞中的表達,并進行統(tǒng)計學分析。第三部分培養(yǎng)人晶狀體上皮細胞,將hsa-miRNA-15a過表達于人晶狀體上皮細胞,檢測hsa-miRNA-15a對晶狀體上皮細胞凋亡的影響,從而進一步明確其對細胞凋亡產(chǎn)生的作用。選取人晶狀體上皮細胞進行培養(yǎng),分別轉染hsa-miRNA-15a-5p和hsa-miRNA-15a-3p,采取Real-time PCR驗證其在培養(yǎng)人細胞中的表達量,電鏡觀察轉染細胞形態(tài)學改變,通過MTS、平板克隆細胞增殖試驗,Hoechst、TUNEL、 AnnexinV-FTTC/PI凋亡檢測及細胞劃痕實驗和Transwell侵襲遷移實驗檢測細胞功能學的改變。研究結果1.通過對年齡相關性白內障晶狀體上皮細胞和正常晶狀體細胞樣品miRNAs芯片表達譜的結果分析,以上調或下調2倍為基準,通過篩選,其中有181個miRNAs上調,有114個miRNAs下調。在這些miRNAs中,有126個上調超過5倍；有51個下調超過5倍。2.通過Real-time PCR檢測結果顯示：hsa-miRNA-15a-5p、hsa-miRNA-15a-3p、在正常晶狀體上皮細胞中有少量表達,而在皮質性、核性及后囊下型白內障晶狀體上皮細胞表達量明顯增高,在皮質性白內障晶狀體上皮細胞中表達水平可達正常晶狀體的5-8倍,在核型白內障中達到10倍以上,在后囊下型白內障中甚至可達20倍以上。統(tǒng)計學分析結果顯示,hsa-miRNA-15a-5p在皮質性白內障組、核性白內障組、后囊下型白內障組中平均相對表達量與對照組比較差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P0.01)；hsa-miRNA-15a-3p在皮質性白內障組、核性白內障組、后囊下型白內障組中平均相對表達量與對照組比較差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P0.01)。Real-time PCR和Western-blot檢測結果均顯示：bcl-2和mcl-1在正常晶狀體上皮細胞中可見表達,而在皮質性、核性及后囊下型白內障晶狀體上皮細胞中表達量明顯下調。統(tǒng)計學分析顯示,bcl-2在皮質性白內障組、核性白內障組、后囊下型白內障組中平均相對表達量與對照組比較差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P0.01)；mcl-1在在皮質性白內障組、核性白內障組、后囊下型白內障組中平均相對表達量與對照組比較差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P0.01)。3.采用經(jīng)典的Taqman探針方法,對轉染了hsa-miRNA-15a-5p、 hsa-miRNA-15a-3p的人晶狀體上皮細胞(Human Lens Epithelial, HLE-B3)進行了定量分析。結果顯示在HLE-B3細胞中未檢測到hsa-miRNA-15a-5p或hsa-miRNA-15a-3p,可能極低甚至不表達這兩種miRNA;轉染了hsa-miRNA-15a-5p和hsa-miRNA-15a-3p的HLE-B3細胞中,這兩種miRNA表達均有顯著提高。細胞形態(tài)顯示轉染了這兩種miRNA的細胞,從24h就開始發(fā)生改變,細胞變大變圓,輪廓不清,交織的網(wǎng)狀結構減少。MTS結果顯示轉染了這兩種miRNA之后,其生長明顯受到抑制。hsa-miRN A-15a-3p對HLE-B3生長的最大抑制率達到57.13%, hsa-miRNA-15a-5p對HLE-B3生長的最大抑制率達到44.60%。平板克隆結果顯示hsa-miRNA-15a-5p和hsa-miRNA-15a-3p對HLE-B3細胞的克隆形成能力也有明顯的抑制作用,TUNEL凋亡檢測結果顯示：轉染了這兩種miRNA的HLE-B3細胞檢測到明顯的綠色熒光,說明這兩種miRNA誘發(fā)了HLE-B3細胞的凋亡。Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測顯示轉染后的HLE-B3細胞,其細胞碎片明顯多于對照組；劃痕實驗結果顯示轉染了hsa-miRNA-15a-5p的HLE-B3細胞的水平遷移能力受到明顯抑制,而轉染hsa-miRNA-15a-3p的細胞沒有影響。結論1.年齡相關性白內障晶狀體上皮細胞中niRNAs表達譜與正常晶狀體上皮細胞表達譜有差異,差異表達的miRNAs可能參與了年齡相關性白內障的發(fā)生。2. hsa-miRNA-15a-5p和hsa-miRNA-15a-3p在三種不同類型的年齡相關性白內障晶狀體上皮細胞中表達均較正常晶狀體上皮細胞表達升高；而bcl-2和mcl-1均較正常晶狀體上皮細胞表達降低o hsa-miRNA-15a-5p、hsa-miRNA-15a-3p可能通過抑制其靶基因bcl-2和mcl-1的表達促使細胞凋亡,導致年齡相關性白內障發(fā)生。3.hsa-miRNA-15a-5p和hsa-miRNA-15a-3p轉染人晶狀體上皮細胞后抑制細胞增殖及克隆,促使晶狀體上皮細胞發(fā)生調亡,從而啟動了年齡相關性白內障的發(fā)生。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R776.1

【參考文獻】

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本文編號：2323360