發(fā)布時間：2018-11-09 10:53

【摘要】：研究背景： 青光眼濾過術(shù)后纖維組織增生引起瘢痕粘連導(dǎo)致濾過泡瘢痕化是青光眼手術(shù)失敗的最主要原因�；谛×呵谐g(shù)后濾過泡瘢痕化的病理生理特點,近年來國內(nèi)外專家們采用復(fù)合式小梁切除術(shù)以減少濾過道瘢痕形成,顯著減少了并發(fā)癥,提高了手術(shù)成功率。該技術(shù)包括：改進手術(shù)方式和技巧,引入非穿透小梁切除術(shù),在術(shù)中外置可拆除鞏膜縫線,術(shù)后控制性定量拆除或激光松解鞏膜縫線；術(shù)中術(shù)后使用抑制瘢痕形成的藥物；術(shù)中使用植入物。 非穿透小梁切除術(shù)是是20世紀(jì)80年代開始興起的手術(shù),它在鞏膜表層下作深層鞏膜、Schlemm管外壁、前小梁和狄氏膜前的角膜基質(zhì)切除,保留自然的小梁狄氏膜作為濾過層,并在鞏膜層間植入透明質(zhì)酸鈉生物膠,使房水通暢外滲的同時有一些阻力,在眼壓逐步降低時保持眼球完整性,由此建立一個鞏膜內(nèi)空間,使房水在鞏膜腔中經(jīng)不同流出通道進行引流。該手術(shù)優(yōu)點在于：手術(shù)并發(fā)癥相對較低,視力恢復(fù)較快；術(shù)后炎癥反應(yīng)較輕；濾過泡更加彌散及扁平；眼內(nèi)炎的發(fā)生率較低。 目前臨床應(yīng)用較多的預(yù)防瘢痕形成的藥物只有5-Fu和絲裂霉素C(MMC)。絲裂霉素C是使用最早抗代謝藥物之一,抗增殖作用很強,約為同劑量5-Fu的100倍,可明顯抑制成纖維細胞增殖,延緩術(shù)后傷口瘢痕愈合的過程,且并發(fā)癥發(fā)生率低于5-FU,可提高預(yù)后較差眼的青光眼手術(shù)成功率,其效果已經(jīng)臨床和詢證醫(yī)學(xué)驗證。臨床常在術(shù)中用MMC0.2～0.4mg/ml的棉片置于鞏膜瓣、結(jié)膜瓣下2-5分鐘,然后用生理鹽水沖洗。但局部單獨一次性給藥方式遠期易形成包裹性無功能濾過泡,導(dǎo)致手術(shù)失敗。 青光眼濾過手術(shù)研究的主要方向之一就是植入材料的改進�，F(xiàn)有的術(shù)中植入物有包括透明質(zhì)酸鈉凝膠、生物膜、晶體前囊膜、膠原膜、自體鞏膜條等,可機械隔離鞏膜瓣和鞏膜床,避免或減少纖維粘連,保持濾過道通暢�，F(xiàn)在常用的透明質(zhì)酸鈉凝膠和膠原的生物降解期大約只有3-6個月。當(dāng)植入物降解過程中,非穿透部分的濾過膜表面會逐漸發(fā)生纖維增殖而變厚。從而房水的濾過效果可能受到影響,減壓室也常常會因纖維增殖而逐漸減小,甚至完全消失。羊膜、鞏膜條等植入物可能引起免疫排斥反應(yīng)等副作用。而透明質(zhì)酸鈉凝膠則因來源受限、價格昂貴而難以普及。因此我們考慮植入材料的改進。在材料的改進上應(yīng)該選擇成型性好、生物相容性良好、眼內(nèi)降解緩慢、且具有一定的抑制成纖維細胞生長作用的生物材料。殼聚糖是一種良好的可降解的天然生物材料,具有良好的組織相容性,且具有止血和抑菌作用,可調(diào)節(jié)免疫功能、促進組織修復(fù)、抑制結(jié)締組織增生、減少瘢痕粘連等作用。同時它也是一類重要的控制釋放給藥系統(tǒng),臨床上廣泛用于預(yù)防骨關(guān)節(jié)、腹腔術(shù)后粘連,可作為眼科粘彈劑使用,具有廣泛的應(yīng)用前景。 基于以上研究基礎(chǔ)和文獻復(fù)習(xí),我們希望在植入物中整合抗纖維化藥物,即研制良好組織相容性的嵌合式絲裂霉素C殼聚糖的緩釋海綿,進行體外及體內(nèi)動物實驗研究,從而達到有效地抑制成纖維細胞的增生,減少濾過泡的瘢痕形成,提高青光眼手術(shù)成功率。 第一章嵌合式絲裂霉素殼聚糖緩釋海綿的制備 目的： 通過制劑學(xué)手段將藥物和材料結(jié)合起來,制備性質(zhì)穩(wěn)定的嵌合式絲裂霉素殼聚糖緩釋海綿。 方法： (1)選用高脫乙酰度的殼聚糖為基本原料同時復(fù)合醫(yī)用幾丁糖通過冷凍干燥,制備殼聚糖海綿； (2)采用二次冷凍干燥技術(shù)將兩種材料進行嵌合,制備不同濃度的絲裂霉素殼聚糖緩釋海綿(MMC-SPCM),使制品的孔隙率更大,孔徑更小,更利于藥物的填充和負載； (3)采用SD大鼠體內(nèi)植入MMC-SPCM,測定其組織相容性和體內(nèi)降解性。 統(tǒng)計學(xué)處理： 使用SPSS13軟件,對海綿干、濕態(tài)厚度進行分析,采用單因素方差LSD’法進行組間兩兩比較,P0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： (1)制備不同濃度的新型嵌合式絲裂霉素C的載藥緩釋海綿；海綿干濕態(tài)厚度比較,P干態(tài)=0.593,P濕態(tài)=0.2033,各組間均沒有顯著性差異(P0.01)； (2)檢測載藥海綿有效地體外緩釋的藥物釋放量； (3)載藥海綿在大鼠體內(nèi)無毒副作用,體內(nèi)吸收時間3月以上。 結(jié)論： (1)成功制備不同濃度的新型嵌合式絲裂霉素C的載藥緩釋海綿； (2)嵌合式絲裂霉素C的載藥緩釋海綿具有良好的生物相容性及生物降解性,為其作為體內(nèi)植入材料提供了理論依據(jù)。 第二章絲裂霉素緩釋海綿促進成纖維細胞凋亡體外實驗研究 目的： 確認MMC-SPCM中絲裂霉素的生物學(xué)活性,體外驗證該控釋系統(tǒng)可以促進成纖維細胞凋亡；同時探索最低有效抑制成纖維細胞增殖的較低絲裂霉素濃度。 方法： (1)采用組織塊貼壁培養(yǎng)法,培養(yǎng)原代人Tenon's囊成纖維細胞； (2)收集穩(wěn)定傳代4-6代的人Tenon's囊成纖維細胞,將其分為四組：A組--絲裂霉素緩釋海綿組(MMC-SPCM組)、B組--單純絲裂霉素組(MMC組)、C組--殼聚糖海綿組(SPCM組)和D組--磷酸鹽緩沖液組為空白對照組(PBS組)。在MMC-SPCM組中加入2.5mm*5mm大小的絲裂霉素緩釋海綿,其中含有MMC含量分別為250、100、50、25、組加入不同濃度的絲裂霉素(MMC濃度分別為250、100、50、25、組中加入2.5mm*5mm大小的殼聚糖海綿；PBS組設(shè)空白對照組；用CCK-8法檢測對人Tenon's囊成纖維細胞的生長抑制作用； (3)顯微鏡觀察細胞形態(tài)、數(shù)量并照相； (4)采用碘化丙啶(PI)染色法,流式細胞儀測定細胞凋亡。 統(tǒng)計學(xué)處理： 使用SPSS13軟件,對5種不同濃度和4個處理組數(shù)據(jù)進行方差分析。應(yīng)用LSD法進行組件兩兩比較,P0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： (1)成功培養(yǎng)原代人Tenon's囊成纖維細胞,并經(jīng)免疫熒光證實； (2)隨著樣品中MMC的濃度增加,細胞生長抑制率逐漸升高。濃度25μg/ml即對細胞生長有抑制作用,并且濃度為50μg/ml的MMC-SPCM組與100μg/ml的MMC組抑制率分別為77.48%和76.18%,兩者抑制率相當(dāng)； (3) MMC-SPCM影響人Tenon's囊成纖維細胞的形態(tài),使正常細胞形狀改變,細胞數(shù)減少,凋亡和壞死細胞增多； (4)通過流式細胞儀進行細胞周期分析發(fā)現(xiàn),絲裂霉素濃度較高時,人Tenon's囊成纖維細胞凋亡率明顯增加。濃度為50μg/ml的MMC-SPCM細胞死亡與凋亡比例適當(dāng)。 結(jié)論： (1)成功培養(yǎng)人Tenon's囊成纖維細胞。 (2)驗證了我們所制備的絲裂霉素殼聚糖緩釋海綿中絲裂霉素的活性正常,能夠促進成纖維細胞的凋亡、抑制成纖維細胞的增殖。 (3)利用CCK-8法和流式細胞儀考察和比較了不同濃度絲裂霉素C對凋亡率的影響,結(jié)果表明較低濃度(25μg/ml)的絲裂霉素殼聚糖緩釋海綿仍然具有抑制人Tenon's囊成纖維細胞增殖的作用,說明其具有緩釋作用。 (4)篩選出濃度為50μg/ml的4MC-SPCM為有效抑制成纖維細胞增生的最佳濃度。為下一步體內(nèi)實驗將絲裂霉素殼聚糖緩釋海綿應(yīng)用于動物實驗研究其在抗青光眼術(shù)后粘連奠定了基礎(chǔ)。 第三章絲裂霉素緩釋海綿預(yù)防青光眼術(shù)后瘢痕化的體內(nèi)實驗研究 目的： 通過動物實驗,觀察研究絲裂霉素緩釋海綿對預(yù)防兔眼青光眼術(shù)后瘢痕化的有效作用,從基因水平證明了絲裂霉素殼聚糖緩釋海綿的有效性。 方法： (1)30只新西蘭兔隨機分為3組,每組10只,右眼為實驗組行非穿透小梁手術(shù)。A組為生理鹽水組(NS組),僅作非穿透小梁手術(shù),瓣下注入生理鹽水；B組植入SPCM組；C組植入MMC-SPCM組。 (2)分別在術(shù)后1天、3天、5天、1周、2周、4周、8周、12周觀察結(jié)膜充血等一般情況、濾過泡高度和面積、眼壓變化(每組6只)。 (3)分別于術(shù)后10d和28d將兔處死(每組2只),3月時處死18只。分別行HE染色和免疫組化染色,觀察其病理改變。 (4)分別于術(shù)后10d將兔處死(每組2只),熒光實時定量PCR,檢測三組VEGF和TGF-β2的]mRNA水平。 統(tǒng)計學(xué)處理： 使用SPSS13軟件,對不同時間段3個處理組的眼壓、濾過泡面積和高度數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用方差分析(ANOVA)對不同時間段3個處理組間的差異進行分析,并采用LSD法或Dunnett T3法進行組間兩兩比較,P0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： (1)術(shù)后裂隙燈下觀察術(shù)眼結(jié)膜、角膜、前房等眼前節(jié)一般情況,三組無明顯差異； (2)術(shù)后濾過泡大小和高度變化,隨著術(shù)后時間延長,逐漸變小、消失。21天時NS組濾過泡完全消失。方差分析三組組間兩兩比較術(shù)后濾過泡情況,濾過泡高度變化：14d時NS組與SPCM組比較,P=0.015,P0.05有顯著差異,NS組與MMC-SPCM組比較,P0.001,有顯著差異；28-84d時,三組組間兩兩比較,P0.001,有顯著差異。濾過泡面積變化：14d時NS組與SPCM組比較,P=0.002,有顯著差異；NS組與MMC-SPCM組比較,P0.001,有顯著差異；28d時,NS組與SPCM組和MMC-SPCM組比較,P0.001,有顯著差異；56-84d時,三組組間兩兩比較,P0.001,有顯著差異。 (3)術(shù)后眼壓變化,術(shù)后3d,NS組分別與SPCM組和MMC-SPCM組比較,P0.001,眼壓變化有顯著差異；術(shù)后5-84d,三組組間P0.001,三組組間兩兩比較眼壓值變化都有顯著性差異。MMC-SPCM組3月時仍能維持較低眼壓； (4)組織病理學(xué)改變：術(shù)后10d時,NS組結(jié)膜、結(jié)膜下及濾過道區(qū)域可見到大量炎性細胞浸潤,以中性粒細胞為主,血管明顯充血擴張,并可見到新生血管和成纖維細胞。濾過道區(qū)域的炎性細胞較前明顯減少,膠原排列較前緊密,成纖維細胞較前增多。MMC-SPCM組,可見殼聚糖海綿,炎性細胞和成纖維細胞最少,SPCM組介于兩者之間。術(shù)后28d,NS組大量膠原纖維增生,排列致密,濾過道基本堵塞。MMC-SPCM組,仍可見膠原纖維疏松和濾過道存在,膜片殘留。術(shù)后3月,MMC-SPCM組,仍可見膠原纖維疏松和濾過道存在。 (5)熒光定量PCR結(jié)果顯示MMC-SPCM組的VEGF和TGF-β2的mRNA水平均遠遠低于NS組和SPCM組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.001)。 結(jié)論： (1)成功建立兔眼青光眼非穿透小梁手術(shù)模型。 (2)通過觀察術(shù)后兔眼前節(jié)一般情況無異常,表明局部應(yīng)用絲裂霉素緩釋海綿對眼內(nèi)組織無明顯毒副作用,組織相容性良好。 (3)通過觀察術(shù)后眼壓、濾過泡的改變和病理組織學(xué)檢查結(jié)果,表明應(yīng)用MMC-SPCM能有效預(yù)防青光眼術(shù)后濾過道瘢痕粘連。 (4)熒光定量PCR結(jié)果顯示,MMC緩釋海綿組通過明顯抑制手術(shù)部位的VEGF和TGF-β2的mRNA水平來抑制成纖維細胞生長,從基因水平證明了MMC-SPCM的有效性。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R779.6

【參考文獻】

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本文編號：2320189