【摘要】：研究背景： 青光眼濾過術(shù)后纖維組織增生引起瘢痕粘連導(dǎo)致濾過泡瘢痕化是青光眼手術(shù)失敗的最主要原因�；谛×呵谐g(shù)后濾過泡瘢痕化的病理生理特點(diǎn),近年來國(guó)內(nèi)外專家們采用復(fù)合式小梁切除術(shù)以減少濾過道瘢痕形成,顯著減少了并發(fā)癥,提高了手術(shù)成功率。該技術(shù)包括：改進(jìn)手術(shù)方式和技巧,引入非穿透小梁切除術(shù),在術(shù)中外置可拆除鞏膜縫線,術(shù)后控制性定量拆除或激光松解鞏膜縫線；術(shù)中術(shù)后使用抑制瘢痕形成的藥物；術(shù)中使用植入物。 非穿透小梁切除術(shù)是是20世紀(jì)80年代開始興起的手術(shù),它在鞏膜表層下作深層鞏膜、Schlemm管外壁、前小梁和狄氏膜前的角膜基質(zhì)切除,保留自然的小梁狄氏膜作為濾過層,并在鞏膜層間植入透明質(zhì)酸鈉生物膠,使房水通暢外滲的同時(shí)有一些阻力,在眼壓逐步降低時(shí)保持眼球完整性,由此建立一個(gè)鞏膜內(nèi)空間,使房水在鞏膜腔中經(jīng)不同流出通道進(jìn)行引流。該手術(shù)優(yōu)點(diǎn)在于：手術(shù)并發(fā)癥相對(duì)較低,視力恢復(fù)較快；術(shù)后炎癥反應(yīng)較輕；濾過泡更加彌散及扁平；眼內(nèi)炎的發(fā)生率較低。 目前臨床應(yīng)用較多的預(yù)防瘢痕形成的藥物只有5-Fu和絲裂霉素C(MMC)。絲裂霉素C是使用最早抗代謝藥物之一,抗增殖作用很強(qiáng),約為同劑量5-Fu的100倍,可明顯抑制成纖維細(xì)胞增殖,延緩術(shù)后傷口瘢痕愈合的過程,且并發(fā)癥發(fā)生率低于5-FU,可提高預(yù)后較差眼的青光眼手術(shù)成功率,其效果已經(jīng)臨床和詢證醫(yī)學(xué)驗(yàn)證。臨床常在術(shù)中用MMC0.2～0.4mg/ml的棉片置于鞏膜瓣、結(jié)膜瓣下2-5分鐘,然后用生理鹽水沖洗。但局部單獨(dú)一次性給藥方式遠(yuǎn)期易形成包裹性無功能濾過泡,導(dǎo)致手術(shù)失敗。 青光眼濾過手術(shù)研究的主要方向之一就是植入材料的改進(jìn)。現(xiàn)有的術(shù)中植入物有包括透明質(zhì)酸鈉凝膠、生物膜、晶體前囊膜、膠原膜、自體鞏膜條等,可機(jī)械隔離鞏膜瓣和鞏膜床,避免或減少纖維粘連,保持濾過道通暢�，F(xiàn)在常用的透明質(zhì)酸鈉凝膠和膠原的生物降解期大約只有3-6個(gè)月。當(dāng)植入物降解過程中,非穿透部分的濾過膜表面會(huì)逐漸發(fā)生纖維增殖而變厚。從而房水的濾過效果可能受到影響,減壓室也常常會(huì)因纖維增殖而逐漸減小,甚至完全消失。羊膜、鞏膜條等植入物可能引起免疫排斥反應(yīng)等副作用。而透明質(zhì)酸鈉凝膠則因來源受限、價(jià)格昂貴而難以普及。因此我們考慮植入材料的改進(jìn)。在材料的改進(jìn)上應(yīng)該選擇成型性好、生物相容性良好、眼內(nèi)降解緩慢、且具有一定的抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)作用的生物材料。殼聚糖是一種良好的可降解的天然生物材料,具有良好的組織相容性,且具有止血和抑菌作用,可調(diào)節(jié)免疫功能、促進(jìn)組織修復(fù)、抑制結(jié)締組織增生、減少瘢痕粘連等作用。同時(shí)它也是一類重要的控制釋放給藥系統(tǒng),臨床上廣泛用于預(yù)防骨關(guān)節(jié)、腹腔術(shù)后粘連,可作為眼科粘彈劑使用,具有廣泛的應(yīng)用前景。 基于以上研究基礎(chǔ)和文獻(xiàn)復(fù)習(xí),我們希望在植入物中整合抗纖維化藥物,即研制良好組織相容性的嵌合式絲裂霉素C殼聚糖的緩釋海綿,進(jìn)行體外及體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究,從而達(dá)到有效地抑制成纖維細(xì)胞的增生,減少濾過泡的瘢痕形成,提高青光眼手術(shù)成功率。 第一章嵌合式絲裂霉素殼聚糖緩釋海綿的制備 目的： 通過制劑學(xué)手段將藥物和材料結(jié)合起來,制備性質(zhì)穩(wěn)定的嵌合式絲裂霉素殼聚糖緩釋海綿。 方法： (1)選用高脫乙酰度的殼聚糖為基本原料同時(shí)復(fù)合醫(yī)用幾丁糖通過冷凍干燥,制備殼聚糖海綿； (2)采用二次冷凍干燥技術(shù)將兩種材料進(jìn)行嵌合,制備不同濃度的絲裂霉素殼聚糖緩釋海綿(MMC-SPCM),使制品的孔隙率更大,孔徑更小,更利于藥物的填充和負(fù)載； (3)采用SD大鼠體內(nèi)植入MMC-SPCM,測(cè)定其組織相容性和體內(nèi)降解性。 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 使用SPSS13軟件,對(duì)海綿干、濕態(tài)厚度進(jìn)行分析,采用單因素方差LSD’法進(jìn)行組間兩兩比較,P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： (1)制備不同濃度的新型嵌合式絲裂霉素C的載藥緩釋海綿；海綿干濕態(tài)厚度比較,P干態(tài)=0.593,P濕態(tài)=0.2033,各組間均沒有顯著性差異(P0.01)； (2)檢測(cè)載藥海綿有效地體外緩釋的藥物釋放量； (3)載藥海綿在大鼠體內(nèi)無毒副作用,體內(nèi)吸收時(shí)間3月以上。 結(jié)論： (1)成功制備不同濃度的新型嵌合式絲裂霉素C的載藥緩釋海綿； (2)嵌合式絲裂霉素C的載藥緩釋海綿具有良好的生物相容性及生物降解性,為其作為體內(nèi)植入材料提供了理論依據(jù)。 第二章絲裂霉素緩釋海綿促進(jìn)成纖維細(xì)胞凋亡體外實(shí)驗(yàn)研究 目的： 確認(rèn)MMC-SPCM中絲裂霉素的生物學(xué)活性,體外驗(yàn)證該控釋系統(tǒng)可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞凋亡；同時(shí)探索最低有效抑制成纖維細(xì)胞增殖的較低絲裂霉素濃度。 方法： (1)采用組織塊貼壁培養(yǎng)法,培養(yǎng)原代人Tenon's囊成纖維細(xì)胞； (2)收集穩(wěn)定傳代4-6代的人Tenon's囊成纖維細(xì)胞,將其分為四組：A組--絲裂霉素緩釋海綿組(MMC-SPCM組)、B組--單純絲裂霉素組(MMC組)、C組--殼聚糖海綿組(SPCM組)和D組--磷酸鹽緩沖液組為空白對(duì)照組(PBS組)。在MMC-SPCM組中加入2.5mm*5mm大小的絲裂霉素緩釋海綿,其中含有MMC含量分別為250、100、50、25、組加入不同濃度的絲裂霉素(MMC濃度分別為250、100、50、25、組中加入2.5mm*5mm大小的殼聚糖海綿；PBS組設(shè)空白對(duì)照組；用CCK-8法檢測(cè)對(duì)人Tenon's囊成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用； (3)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量并照相； (4)采用碘化丙啶(PI)染色法,流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡。 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 使用SPSS13軟件,對(duì)5種不同濃度和4個(gè)處理組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。應(yīng)用LSD法進(jìn)行組件兩兩比較,P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： (1)成功培養(yǎng)原代人Tenon's囊成纖維細(xì)胞,并經(jīng)免疫熒光證實(shí)； (2)隨著樣品中MMC的濃度增加,細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率逐漸升高。濃度25μg/ml即對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用,并且濃度為50μg/ml的MMC-SPCM組與100μg/ml的MMC組抑制率分別為77.48%和76.18%,兩者抑制率相當(dāng)； (3) MMC-SPCM影響人Tenon's囊成纖維細(xì)胞的形態(tài),使正常細(xì)胞形狀改變,細(xì)胞數(shù)減少,凋亡和壞死細(xì)胞增多； (4)通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn),絲裂霉素濃度較高時(shí),人Tenon's囊成纖維細(xì)胞凋亡率明顯增加。濃度為50μg/ml的MMC-SPCM細(xì)胞死亡與凋亡比例適當(dāng)。 結(jié)論： (1)成功培養(yǎng)人Tenon's囊成纖維細(xì)胞。 (2)驗(yàn)證了我們所制備的絲裂霉素殼聚糖緩釋海綿中絲裂霉素的活性正常,能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞的凋亡、抑制成纖維細(xì)胞的增殖。 (3)利用CCK-8法和流式細(xì)胞儀考察和比較了不同濃度絲裂霉素C對(duì)凋亡率的影響,結(jié)果表明較低濃度(25μg/ml)的絲裂霉素殼聚糖緩釋海綿仍然具有抑制人Tenon's囊成纖維細(xì)胞增殖的作用,說明其具有緩釋作用。 (4)篩選出濃度為50μg/ml的4MC-SPCM為有效抑制成纖維細(xì)胞增生的最佳濃度。為下一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)將絲裂霉素殼聚糖緩釋海綿應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究其在抗青光眼術(shù)后粘連奠定了基礎(chǔ)。 第三章絲裂霉素緩釋海綿預(yù)防青光眼術(shù)后瘢痕化的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究 目的： 通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn),觀察研究絲裂霉素緩釋海綿對(duì)預(yù)防兔眼青光眼術(shù)后瘢痕化的有效作用,從基因水平證明了絲裂霉素殼聚糖緩釋海綿的有效性。 方法： (1)30只新西蘭兔隨機(jī)分為3組,每組10只,右眼為實(shí)驗(yàn)組行非穿透小梁手術(shù)。A組為生理鹽水組(NS組),僅作非穿透小梁手術(shù),瓣下注入生理鹽水；B組植入SPCM組；C組植入MMC-SPCM組。 (2)分別在術(shù)后1天、3天、5天、1周、2周、4周、8周、12周觀察結(jié)膜充血等一般情況、濾過泡高度和面積、眼壓變化(每組6只)。 (3)分別于術(shù)后10d和28d將兔處死(每組2只),3月時(shí)處死18只。分別行HE染色和免疫組化染色,觀察其病理改變。 (4)分別于術(shù)后10d將兔處死(每組2只),熒光實(shí)時(shí)定量PCR,檢測(cè)三組VEGF和TGF-β2的]mRNA水平。 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 使用SPSS13軟件,對(duì)不同時(shí)間段3個(gè)處理組的眼壓、濾過泡面積和高度數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用方差分析(ANOVA)對(duì)不同時(shí)間段3個(gè)處理組間的差異進(jìn)行分析,并采用LSD法或Dunnett T3法進(jìn)行組間兩兩比較,P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： (1)術(shù)后裂隙燈下觀察術(shù)眼結(jié)膜、角膜、前房等眼前節(jié)一般情況,三組無明顯差異； (2)術(shù)后濾過泡大小和高度變化,隨著術(shù)后時(shí)間延長(zhǎng),逐漸變小、消失。21天時(shí)NS組濾過泡完全消失。方差分析三組組間兩兩比較術(shù)后濾過泡情況,濾過泡高度變化：14d時(shí)NS組與SPCM組比較,P=0.015,P0.05有顯著差異,NS組與MMC-SPCM組比較,P0.001,有顯著差異；28-84d時(shí),三組組間兩兩比較,P0.001,有顯著差異。濾過泡面積變化：14d時(shí)NS組與SPCM組比較,P=0.002,有顯著差異；NS組與MMC-SPCM組比較,P0.001,有顯著差異；28d時(shí),NS組與SPCM組和MMC-SPCM組比較,P0.001,有顯著差異；56-84d時(shí),三組組間兩兩比較,P0.001,有顯著差異。 (3)術(shù)后眼壓變化,術(shù)后3d,NS組分別與SPCM組和MMC-SPCM組比較,P0.001,眼壓變化有顯著差異；術(shù)后5-84d,三組組間P0.001,三組組間兩兩比較眼壓值變化都有顯著性差異。MMC-SPCM組3月時(shí)仍能維持較低眼壓； (4)組織病理學(xué)改變：術(shù)后10d時(shí),NS組結(jié)膜、結(jié)膜下及濾過道區(qū)域可見到大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),以中性粒細(xì)胞為主,血管明顯充血擴(kuò)張,并可見到新生血管和成纖維細(xì)胞。濾過道區(qū)域的炎性細(xì)胞較前明顯減少,膠原排列較前緊密,成纖維細(xì)胞較前增多。MMC-SPCM組,可見殼聚糖海綿,炎性細(xì)胞和成纖維細(xì)胞最少,SPCM組介于兩者之間。術(shù)后28d,NS組大量膠原纖維增生,排列致密,濾過道基本堵塞。MMC-SPCM組,仍可見膠原纖維疏松和濾過道存在,膜片殘留。術(shù)后3月,MMC-SPCM組,仍可見膠原纖維疏松和濾過道存在。 (5)熒光定量PCR結(jié)果顯示MMC-SPCM組的VEGF和TGF-β2的mRNA水平均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于NS組和SPCM組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。 結(jié)論： (1)成功建立兔眼青光眼非穿透小梁手術(shù)模型。 (2)通過觀察術(shù)后兔眼前節(jié)一般情況無異常,表明局部應(yīng)用絲裂霉素緩釋海綿對(duì)眼內(nèi)組織無明顯毒副作用,組織相容性良好。 (3)通過觀察術(shù)后眼壓、濾過泡的改變和病理組織學(xué)檢查結(jié)果,表明應(yīng)用MMC-SPCM能有效預(yù)防青光眼術(shù)后濾過道瘢痕粘連。 (4)熒光定量PCR結(jié)果顯示,MMC緩釋海綿組通過明顯抑制手術(shù)部位的VEGF和TGF-β2的mRNA水平來抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng),從基因水平證明了MMC-SPCM的有效性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R779.6

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2320189