【摘要】：研究背景:近年隨著人們飲食結(jié)構(gòu)及生活方式的改變,糖尿病(diabetic mellitus,DM)患者的人數(shù)逐年攀升,糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)的發(fā)病率也隨之急劇增長(zhǎng),成為工作年齡組人群的主要致盲原因之一。目前DR發(fā)病機(jī)制尚不明確,其中炎癥反應(yīng)成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn),在DR的發(fā)生及發(fā)展中起到了重要作用,表現(xiàn)為促炎性細(xì)胞因子和粘附分子表達(dá)增加、白細(xì)胞瘀滯,進(jìn)而導(dǎo)致血視網(wǎng)膜屏障(blood retinal barrier,BRB)破壞。FTY720是一種通過(guò)冬蟲(chóng)夏草中提取的有效成分多球殼菌素結(jié)構(gòu)改造而合成的新型免疫抑制劑,主要通過(guò)結(jié)合細(xì)胞表面的鞘氨醇-1-磷酸受體(sphingosine-1-phosphate receptor,S1PR)發(fā)揮作用。目前研究表明,FTY720對(duì)多種免疫相關(guān)性疾病及心血管疾病治療有效,但其對(duì)大鼠DR是否具有治療作用尚不清楚。另外,內(nèi)皮細(xì)胞表面主要表達(dá)S1P1和S1P3,二者在維護(hù)血管完整性方面發(fā)揮重要作用。但是,S1P1/S1P3是否參與DR的發(fā)病,且FTY720是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜S1P1/S1P3保護(hù)DM大鼠BRB尚不清楚,需要進(jìn)一步探討。目的:(1)探討FTY720對(duì)大鼠DR是否具有治療作用,包括炎癥抑制和保護(hù)BRB兩個(gè)方面;(2)探討視網(wǎng)膜S1P1/S1P3是否參與DR的發(fā)病;(3)探討FTY720是否可以通過(guò)直接調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜S1P1/S1P3發(fā)揮保護(hù)BRB的作用。方法:(1)雄性Wistar大鼠45只,隨機(jī)分為正常對(duì)照組(control組,n=15)和DM組(n=30)。DM組大鼠通過(guò)一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotozin,STZ,60mg/kg)建立DR模型。DM模型建立成功后,分別于病程4周、8周和12周檢測(cè)各組大鼠體重及空腹血糖;分別于病程4周、12周處死DM組大鼠各15只,12周處死所有control組大鼠,并取材用于相關(guān)實(shí)驗(yàn)。采用蘇木精-伊紅(HE)染色,觀(guān)察各組大鼠視網(wǎng)膜的組織病理學(xué)改變;采用伊文思藍(lán)(Evens Blue,EB)灌注血管造影視網(wǎng)膜鋪片,觀(guān)察視網(wǎng)膜血管滲漏情況;采用Western blot檢測(cè)視網(wǎng)膜VEGF表達(dá)。(2)雄性Wistar大鼠150只,通過(guò)一次性腹腔注射STZ(60mg/kg)建立大鼠DR模型。DM模型建立成功后,將DM大鼠隨機(jī)分為DM組和FTY720干預(yù)組(DM+FTY720組),正常大鼠用作對(duì)照(control組),每組各50只。DM+FTY720組大鼠每天灌胃給予FTY720,1次/天,劑量為0.3mg/kg,持續(xù)12周。分別于4周、8周和12周,檢測(cè)各組大鼠體重及空腹血糖水平。12周后,所有大鼠均處死并用于相關(guān)實(shí)驗(yàn)。采用HE染色,觀(guān)察各組大鼠視網(wǎng)膜的組織病理學(xué)改變;采集外周血檢測(cè)淋巴細(xì)胞數(shù)量;采用Western Blot法檢測(cè)視網(wǎng)膜組織炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β表達(dá)情況;采用FITC標(biāo)記的刀豆素蛋白(Con A)灌注染色檢測(cè)視網(wǎng)膜血管內(nèi)白細(xì)胞粘附情況,并在共聚焦熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)粘附的白細(xì)胞數(shù)目;采用Western Blot、免疫組織化學(xué)染色和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative Real Time-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)檢測(cè)視網(wǎng)膜細(xì)胞間粘附分子1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)和血管細(xì)胞粘附分子1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)的分布及表達(dá);采用Western Blot和RT-PCR檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中NF-κB(p65)的表達(dá);采用免疫熒光染色檢測(cè)視網(wǎng)膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況,包括CD45陽(yáng)性的全部白細(xì)胞、CD11b陽(yáng)性的巨噬細(xì)胞/活化小膠質(zhì)細(xì)胞和CD3陽(yáng)性的淋巴細(xì)胞;采用EB灌注血管造影視網(wǎng)膜鋪片,觀(guān)察視網(wǎng)膜血管滲漏情況,并定量檢測(cè)視網(wǎng)膜血管滲漏量;采用Western Blot和免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)視網(wǎng)膜緊密連接蛋白的分布及表達(dá)情況,包括ZO-1,Occludin和Claudin-5;采用RT-PCR檢測(cè)視網(wǎng)膜S1P1和S1P3的m RNA表達(dá)水平。結(jié)果:(1)DM組大鼠各時(shí)間點(diǎn)空腹血糖明顯升高,而體重顯著下降。HE染色顯示DM組大鼠視網(wǎng)膜各層細(xì)胞排列紊亂,細(xì)胞核疏松,且病程12周時(shí)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層可見(jiàn)空泡樣變性及部分血管擴(kuò)張;EB灌注血管造影視網(wǎng)膜鋪片顯示,DM4周時(shí)視網(wǎng)膜血管可見(jiàn)少量熒光滲漏,12周時(shí)可見(jiàn)大量彌慢性熒光滲漏;與正常大鼠相比,DM組大鼠視網(wǎng)膜VEGF表達(dá)顯著增加,且DM12w組顯著高于DM4w組。(2)DM組與DM+FTY720組大鼠各時(shí)間點(diǎn)空腹血糖明顯升高,而體重顯著下降;HE染色顯示,DM組大鼠視網(wǎng)膜厚度變薄,各層細(xì)胞排列紊亂、邊界不清,細(xì)胞核腫脹、體積增大,可見(jiàn)部分血管擴(kuò)張;FTY720治療后DM大鼠視網(wǎng)膜厚度增加,各層細(xì)胞排列逐漸恢復(fù)正常,細(xì)胞核腫脹減輕;外周血檢測(cè)結(jié)果表明,DM+FTY720組大鼠外周血淋巴細(xì)胞數(shù)目較DM大鼠顯著減少;與正常大鼠相比,DM大鼠視網(wǎng)膜組織中TNF-α、IL-6和IL-1β表達(dá)顯著增加,而DM+FTY720組大鼠三者表達(dá)均較糖尿病組顯著下降;FITC-Con A灌注染色顯示,DM大鼠視網(wǎng)膜血管中有大量白細(xì)胞粘附且血管分叉處多見(jiàn),而DM+FTY720組大鼠視網(wǎng)膜血管中偶爾可見(jiàn)少量白細(xì)胞粘附;白細(xì)胞粘附計(jì)數(shù)結(jié)果表明,DM+FTY720組大鼠視網(wǎng)膜血管粘附的白細(xì)胞數(shù)目較DM組顯著減少,;免疫組織化學(xué)染色顯示,DM大鼠視網(wǎng)膜組織中有大量ICAM-1和VCAM-1陽(yáng)性細(xì)胞且主要分布在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及神經(jīng)纖維層,而DM+FTY720組大鼠視網(wǎng)膜組織中僅有少量陽(yáng)性細(xì)胞分布;Western blot和RT-PCR檢測(cè)表明,在蛋白及m RNA水平上,DM大鼠視網(wǎng)膜組織中ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)均較正常大鼠顯著增加,而DM+FTY720組大鼠視網(wǎng)膜組織中兩者的表達(dá)均較DM組顯著減少;Western blot和RT-PCR檢測(cè)表明,在蛋白及m RNA水平上,DM大鼠視網(wǎng)膜組織中NF-κB(p65)的表達(dá)較正常大鼠顯著增加,而FTY720治療可以顯著下調(diào)其表達(dá);免疫熒光染色顯示,DM大鼠視網(wǎng)膜組織中有大量CD45陽(yáng)性的白細(xì)胞浸潤(rùn),包括CD11b陽(yáng)性的巨噬細(xì)胞/活化的小膠質(zhì)細(xì)胞,而DM+FTY720組大鼠視網(wǎng)膜組織中僅有少量CD45和CD11b陽(yáng)性細(xì)胞,三組大鼠視網(wǎng)膜中均未見(jiàn)明顯的CD3陽(yáng)性T細(xì)胞;EB灌注血管造影視網(wǎng)膜鋪片顯示,DM大鼠視網(wǎng)膜血管有明顯的熒光滲漏,而DM+FTY720組大鼠視網(wǎng)膜血管僅可見(jiàn)局部少量滲漏;視網(wǎng)膜EB滲漏定量分析表明,DM大鼠視網(wǎng)膜血管滲漏量顯著高于正常大鼠,而DM+FTY720組大鼠視網(wǎng)膜血管滲漏較DM大鼠顯著減少;免疫組織化學(xué)染色顯示,正常大鼠視網(wǎng)膜組織有大量ZO-1、Occludin和Claudin-5陽(yáng)性細(xì)胞且主要分布于神經(jīng)纖維層、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層及外從狀層,DM大鼠視網(wǎng)膜組織中僅可見(jiàn)少量陽(yáng)性細(xì)胞,而DM+FTY720組大鼠視網(wǎng)膜組織中三種陽(yáng)性細(xì)胞分布較多;Western blot檢測(cè)表明,DM大鼠視網(wǎng)膜組織ZO-1、Occludin和Claudin-5的表達(dá)均較正常大鼠明顯減少,而DM+FTY720組三者表達(dá)均較DM大鼠顯著增加;RT-PCR結(jié)果顯示,m RNA水平上正常大鼠視網(wǎng)膜組織中有大量S1P1和S1P3表達(dá),DM大鼠視網(wǎng)膜中兩者表達(dá)均較正常組減少,而DM+FTY720組兩者表達(dá)較均DM大鼠顯著增加。結(jié)論:(1)FTY720可以抑制DM大鼠視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng),并保護(hù)視網(wǎng)膜血管完整性;(2)DM大鼠視網(wǎng)膜組織中S1P1/S1P3的下調(diào)可能參與了BRB破壞;(3)FTY720通過(guò)兩種機(jī)制發(fā)揮保護(hù)BRB的作用,一種是抑制炎癥反應(yīng),另一種是直接上調(diào)視網(wǎng)膜組織中S1P1/S1P3表達(dá)。
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【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R587.2;R774.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 Ruth E.Rosenstein;Diego C.Fernandez;;Induction of ischemic tolerance as a promising treatment against diabetic retinopathy[J];Neural Regeneration Research;2014年17期

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本文編號(hào)：2318704