【摘要】：研究背景及目的:AMD (age-related macular degeneration,年齡相關(guān)性黃斑變性)其臨床特點(diǎn)之一是玻璃膜疣的形成。RPE (retinal pigment epithelial,視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞)是AMD研究的核心細(xì)胞。玻璃膜疣的重要組份之一——CLU(clusterin,叢生蛋白)能保護(hù)RPE細(xì)胞免受氧化應(yīng)激所致凋亡。體內(nèi)非編碼RNA中具有重要功能的包括 miRNA (microRNAs,小 RNA)和 lncRNA (long noncoding RNAs,長鏈非編碼RNA)。這兩者均參與了體內(nèi)基因表達(dá)修飾及調(diào)控過程。然而,在CLU作用下的RPE細(xì)胞中,其下游特定的miRNA及l(fā)ncRNA出現(xiàn)怎樣的改變,目前尚不清楚。希望通過本研究闡明CLU對(duì)RPE細(xì)胞穩(wěn)定性的影響,觀察CLU作用下RPE細(xì)胞中mRNA、miRNA及l(fā)ncRNA差異表達(dá)變化,構(gòu)建lncRNA-mRNA-miRNA基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行功能性驗(yàn)證和分析。方法·①M(fèi)TT法檢測CLU作用下人RPE細(xì)胞株D407細(xì)胞穩(wěn)定性。②高通量測序法檢測CLU作用下D407細(xì)胞中mRNA、miRNA及l(fā)ncRNA表達(dá)差異。③構(gòu)建lncRNA-mRNA-miRNA相關(guān)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò),篩選目標(biāo)靶基因并對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。④建立Aβ25-35誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞毒性模型,采用Western blot和RT-PCT的方法研究目標(biāo)靶基因hsa-miR-1273g-3p參與AMD可能的發(fā)病機(jī)制。結(jié)果:①CLU的任一濃度和時(shí)間均不會(huì)給D407細(xì)胞的活力和增殖帶來負(fù)面作用,也不影響RPE細(xì)胞的生存力。②mRNA、miRNA及l(fā)ncRNA表達(dá)差異檢測結(jié)果:經(jīng)CLU處理后RPE細(xì)胞中總共有321個(gè)基因表達(dá)呈現(xiàn)差異,其中有71個(gè)基因表達(dá)升高,250個(gè)基因表達(dá)降低;有36個(gè)miRNA呈現(xiàn)異常表達(dá)。與對(duì)照組對(duì)比,經(jīng)CLU處理后的實(shí)驗(yàn)組中共檢測出296個(gè)已知lncRNA和90個(gè)新發(fā)現(xiàn)的lncRNA。經(jīng)分析,共有66對(duì)差異表達(dá)的miRNA-mRNA。其中大部分是多個(gè)目標(biāo)靶基因與一個(gè)miRNA相對(duì)應(yīng),個(gè)別是一個(gè)目標(biāo)靶基因只與一個(gè)miRNA相連的單一對(duì)應(yīng)關(guān)系。③構(gòu)建ceRNA基因網(wǎng)絡(luò):篩選出代表性差異基因并對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證,包括:靶基因EN(engrailed,同源盒蛋白轉(zhuǎn)錄因子)1、EN2、EDN2(endothelin2,人內(nèi)皮素2)、MYLIP (myosin regulatory light chain interacting protein,肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈相互作用蛋白)和 C5AR2 (complement component 5areceptor 2,補(bǔ)體成分 5a 受體 2 基因);lncRNA NR_036461 (HIST2H2BC)和 NR_02376 (TOPORS-AS1) ; miRNA hsa-miR-1273g-3p、hsa-miR-5582-3p 和 hsa-miR-1293。其中,hsa-miR-1273g-3p 與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。④建立Aβ25-35誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞毒性模型,發(fā)現(xiàn)hsa-miR-1273g-3p能調(diào)控Aβ25-35寡聚體誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞毒性模型中炎癥反應(yīng)相關(guān)因子如 MMP-2 (matrixmetalloproteinase-2,基質(zhì)金屬蛋白酶 2)、MMP-9 和 TNF-α(tumour necrosis factor α,腫瘤壞死因子αα)的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平,hsa-miR-1273g-3p能調(diào)控自體吞噬相關(guān)蛋白酶的表達(dá),從而調(diào)控溶酶體介導(dǎo)的自體吞噬途徑,進(jìn)而參與AMD發(fā)生機(jī)制。結(jié)論:本研究分析了 CLU作用下RPE細(xì)胞中mRNA、miRNA及l(fā)ncRNA差異表達(dá)變化,篩選出代表性差異表達(dá)基因并進(jìn)行了驗(yàn)證。其中最重要的與炎癥反應(yīng)相關(guān)的基因是hsa-miR-1273g-3p。通過建立Aβ25-35誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞毒性模型,首次研究了 hsa-miR-1273g-3p參與AMD發(fā)生及RPE細(xì)胞損傷機(jī)制,這為進(jìn)一步研究AMD發(fā)病機(jī)制及探求新的治療靶點(diǎn)提供了理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R774.5

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Yun-Mi Jeong;Tae-Eun Jin;Jung-Hwa Choi;Mi-Sun Lee;Hyun-Taek Kim;Kyu-Seok Hwang;Doo-Sang Park;Hyun-Woo Oh;Joong-Kook Choi;Vladimir Korzh;Melitta Schachner;Kwan-Hee You;Cheol-Hee Kim;;Induction of clusterin Expression by Neuronal Cell Death in Zebrafish[J];Journal of Genetics and Genomics;2014年11期

，

本文編號(hào)：2309132