【摘要】：第一部分HMGA2在鼻咽癌中的表達(dá)及臨床意義目的：比較HMGA2在鼻咽癌組織及鼻咽慢性炎組織中的差異,分析HMGA2與臨床病理因素及預(yù)后的關(guān)系。方法：1.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)72例鼻咽癌及20例鼻咽慢性炎石蠟標(biāo)本組織中HMGA2 mRNA表達(dá),分析其與臨床病理因素的關(guān)系。2.采用免疫組化法檢測(cè)124例鼻咽癌及20例鼻咽慢性炎石蠟標(biāo)本組織中HMGA2表達(dá)情況,并分析其與臨床病理因素的關(guān)系。3.采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線,比較HMGA2 mRNA低表達(dá)組及高表達(dá)組3年無(wú)病生存率的差異。4.采用Log-rank檢驗(yàn)比較124例患者免疫組化檢測(cè)HMGA2蛋白低表達(dá)組與高表達(dá)組3年總生存率的差異。風(fēng)險(xiǎn)比例模型(Cox回歸)分析影響預(yù)后的不良因素。結(jié)果：1.72例鼻咽癌組織中HMGA2 mRNA相對(duì)表達(dá)量(中位數(shù)0.294)高于鼻咽慢性炎組織(中位數(shù)0.045),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。HMGA2 mRNA在鼻咽癌組織中的表達(dá)與年齡、性別、分型、分期、復(fù)發(fā)參數(shù)無(wú)關(guān)(P0.05),與鼻咽癌患者的2年內(nèi)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P0.01)。2.124例鼻咽癌標(biāo)本中59例HMGA2蛋白高表達(dá)(陽(yáng)性率：47.58%),20例鼻咽慢性炎HMGA2均無(wú)表達(dá)(陽(yáng)性率：0),鼻咽癌組織中HMGA2表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于慢性炎組織(x2=16.12,P0.01)。124例患者HMGA2蛋白在鼻咽癌中的表達(dá)與患者N分期、TNM分期、2年內(nèi)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移因素有關(guān)(P0.01)。3.定量PCR結(jié)果顯示在生存率方面,HMGA2 mRNA高表達(dá)組的3年無(wú)病生存率相對(duì)較低(HR:3.52; 95% CI:1.34-7.79; P=0.01)。4.免疫組化顯示,全組鼻咽癌患者的3年生存率為78.8%(95%CI:0.708-0.852), HMGA2蛋白低表達(dá)組及高表達(dá)組3年生存率分別為90.8%(95%CI：0.806-0.957)及66.1%(95%CI：0.525-0.766),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。單因素分析得出T分期、N分期,TNM分期及HMGA2高表達(dá)為不良預(yù)后因素。多因素分析得到N分期(HR：7.892,95%CI：2.731-22.807,P0.001)和HMGA2高表達(dá)((HR：2.683,95%CI：1.185-6.077,P=0.018))為影響鼻咽癌患者生存率的獨(dú)立的不良預(yù)后因素。結(jié)論：HMGA2與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展有相關(guān)性,其有可能用于鼻咽癌的預(yù)后監(jiān)測(cè)及作為鼻咽癌治療的靶分子。第二部分HMGA2的表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響目的：體外實(shí)驗(yàn)初步明確HMGA2對(duì)鼻咽癌增殖、生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為的影響。方法：1.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)及Western blot法檢測(cè)人永生化鼻咽上皮細(xì)胞NP-69細(xì)胞株,人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1, CNE-2,5-8F,6-10B, C666-1, HNE-1中HMGA2 mR NA及蛋白的表達(dá)情況。2.選取相對(duì)高表達(dá)HMGA2的兩株細(xì)胞CNE-1、CNE-2,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染si-HMGA2, CCK-8及平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞增殖,[ranswell小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移、侵襲能力,流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞周期的變化。結(jié)果：1.鼻咽癌各細(xì)胞株中HMGA2 mRNA的表達(dá)均顯著高于NP69(P0.01)。同樣,HMGA2蛋白在鼻咽癌腫瘤細(xì)胞中也呈高表達(dá),在正常鼻咽上皮細(xì)胞表達(dá)較低,結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。2.敲低HMGA2表達(dá)可以抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖能力,轉(zhuǎn)染si-HMGA2后,CNE-1和CNE-2細(xì)胞的生長(zhǎng)速度在第2天、第3天、第4天均低于陰性對(duì)照組與空白組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)表明,CNE-1與CNE-2兩株細(xì)胞的si-HMGA2組的細(xì)胞遷移的個(gè)數(shù)為41.22±4.45個(gè)及45.34±6.11個(gè),對(duì)照組遷移的細(xì)胞數(shù)量為141.344±5.22及157.36±6.41,兩組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.001)。侵襲實(shí)驗(yàn)顯示,CNE-1、CNE-2細(xì)胞中si-HMGA2組穿過(guò)Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)分別為34.03±4.56,41.48±5.31,對(duì)照組細(xì)胞數(shù)分別為113.83±4.18及135.33±4.36,兩株細(xì)胞中兩組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.001)。克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示,干擾HMGA2組與對(duì)照組相比CNE-1、CNE-2兩株細(xì)胞的克隆形成率分別降低了45%,55%(P0.001)。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示,si-HMGA2組與對(duì)照組相比,G1期細(xì)胞比例增高(P0.001), G2/M期細(xì)胞比例減少(P0.001)。結(jié)論：體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了HMGA2可能參與了鼻咽癌的一系列惡性生物學(xué)行為,包括腫瘤發(fā)生、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等。第三部分HMGA2誘導(dǎo)E MT對(duì)鼻咽癌惡性生物學(xué)行為影響的機(jī)制目的：檢測(cè)并分析鼻咽癌HMGA2與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)記物表達(dá)的相關(guān)性,初步探討HMGA2促進(jìn)EMT可能的分子機(jī)制。方法：1.免疫組化法檢測(cè)124例鼻咽癌石蠟樣本中E-cadherin、Vimentin在癌組織中的表達(dá)。分析E-cadherin、Vimentin蛋白的表達(dá)與鼻咽癌臨床病理因素及預(yù)后關(guān)系。2. Spearman等級(jí)秩相關(guān)分析HMGA2、E-cadherin、Vimentin兩兩表達(dá)之間的相關(guān)關(guān)系。3. Western blot及細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察CNE-1、CNE-2細(xì)胞株中干擾HMGA2表達(dá)后E-cadherin、Vimentin、Snail在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)變化。4.干擾HMGA2的表達(dá)后,Western blot法觀察TGF-β/Smad通路中關(guān)鍵蛋白的變化。結(jié)果：1. HMGA2表達(dá)見(jiàn)第一部分,E-cadherin陽(yáng)性顆粒主要定位于細(xì)胞膜,Vimentin陽(yáng)性顆粒定位于細(xì)胞漿和／或部分細(xì)胞膜。E-cadherin在20例鼻咽慢性炎組織中15例高表達(dá)(陽(yáng)性率：75%),在鼻咽癌組織中54例高表達(dá)(陽(yáng)性率：43.55%),結(jié)果提示鼻咽癌組織中E-cadherin表達(dá)率低于慢性炎組織(x2=6.826,P0.001); Vimen tin在20例鼻咽慢性炎組織中均陰性表達(dá)(陽(yáng)性率：0),鼻咽癌組織中78例高表達(dá)(陽(yáng)性率：62.9%),提示鼻咽癌組織中Vimentin陽(yáng)性表達(dá)率高于慢性炎組織(x2=27.449, P0.001)。2. E-cadherin在鼻咽癌中的表達(dá)與患者N分期、TNM分期、2年內(nèi)復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移有關(guān)(P0.01)。 Vimentin在鼻咽癌中的表達(dá)與患者N分期、TNM分期、2年內(nèi)復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移有關(guān)(P0.01)。在低表達(dá)E-cadherin組3年總生存率為70%(95%CI：0.578-0.792),而高表達(dá)E-cadherin組3年總生存率為88.8%(95%CI：0.768-0.948)；低表達(dá)Vimentin組3年總生存率為89.1%(95%CI：0.757-0.953),而高表達(dá)Vimentin組3年總生存率為71.8%(95%CI：0.604-0.804),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。3. E-cadherin與Vimentin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)((r=-0.605,P0.001)。HMGA2的表達(dá)水平與Vimentin呈正相關(guān)(r=0.431,P0.001),HMGA2與E-cadherin表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.413,P0.001)。4. Western blot結(jié)果顯示在HMGA2高表達(dá)細(xì)胞株CNE-1、CNE-2中,E-cadherin表達(dá)較低,Vimentin表達(dá)較高,干擾HMGA2后,E-cadherin的表達(dá)均較對(duì)照組上調(diào),Vimentin與Snail的表達(dá)均較對(duì)照組下調(diào)。細(xì)胞免疫熒光觀察CNE-2、CNE-1,干擾HMGA2組綠色熒光標(biāo)記的E-cadherin(定位于胞膜)表達(dá)上調(diào),紅色熒光標(biāo)記Vimentin組(定位于胞漿或胞膜)表達(dá)下調(diào)。5.在細(xì)胞株CNE-1、CNE-2中,觀察TGFβRⅡ、Smad3、p-Smad3的表達(dá)情況,干擾HMGA2的表達(dá)后,發(fā)現(xiàn)TGFβ/Smad通路的關(guān)鍵蛋白TGFβRⅡ、 p-Smad3均顯著下調(diào)。結(jié)論：HMGA2的表達(dá)與EMT的上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān),與間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin表達(dá)呈正相關(guān)。干擾HMGA2可導(dǎo)致E-cadherin上調(diào)、Vimentin下調(diào),并可能通過(guò)TGF-β/Smad信號(hào)通路參與鼻咽癌EMT過(guò)程從而影響鼻咽癌增殖、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.63

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6 馬，

本文編號(hào)：2300271