發(fā)布時(shí)間：2018-10-19 15:54

【摘要】：目的 本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建MMP-3真核表達(dá)質(zhì)粒，探究pEGFP-N1與MMP-3能否成功構(gòu)建真核重組質(zhì)粒。通過原代培養(yǎng)的方法培養(yǎng)豬晶狀體上皮細(xì)胞，進(jìn)而將構(gòu)建的真核重組質(zhì)粒pEGFP-N1-MMP-3轉(zhuǎn)染入培養(yǎng)好的晶狀體上皮細(xì)胞中，通過westernblot檢測表達(dá)產(chǎn)物，觀察MMP-3在豬晶狀體上皮細(xì)胞中是否表達(dá)。以期為研究該蛋白在晶狀體上皮細(xì)胞的表達(dá)與功能奠定基礎(chǔ)。 方法 1.委托生物公司合成人MMP-3。將含有pEGFP-N1的DH5α菌株和含有MMP-3的DH5α菌株接種于制備好的LB培養(yǎng)基中，37oC恒溫?fù)u床培養(yǎng)過夜。12-16h后將菌液按照試劑盒說明提取目的質(zhì)粒。質(zhì)粒MMP-3用限制性內(nèi)切酶XHOⅠ和BglⅡ進(jìn)行雙酶切，載體pEGFP-N1用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BglⅡ進(jìn)行雙酶切，分別將酶切產(chǎn)物中的目的片段進(jìn)行膠回收。連接目的片段pEGFP-N1與MMP-3，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增。分別采用雙酶切與委托生物公司進(jìn)行DNA測序兩種方法鑒定重組質(zhì)粒的正確性。 2.市場新鮮宰殺的生豬眼球取出晶體，經(jīng)抗生素PBS沖洗處理后，手術(shù)顯微鏡下撕取囊膜，以0.25%胰酶消化吸取上清，移入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，離心，去上清，，將重懸后的殘液移入培養(yǎng)皿中，加全培養(yǎng)液37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。顯微鏡下動態(tài)觀察細(xì)胞生長情況，在Nikon熒光顯微鏡下采集圖片。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入晶體上皮細(xì)胞，同時(shí)將不含有質(zhì)粒的脂質(zhì)體作為對照進(jìn)行相同的轉(zhuǎn)染步驟。48h后在Nikon熒光顯微鏡下采集圖像。收獲轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，制備蛋白樣品，用酶標(biāo)儀檢測fibronectin表達(dá)量，從而間接反映MMP-3表達(dá)情況。根據(jù)樣本濃度計(jì)算電泳上樣量，進(jìn)行SDS-PAGE電泳后經(jīng)western blot檢測。用ImageJ1.44軟件灰度分析western blot結(jié)果。 結(jié)果 1.真核表達(dá)載體的構(gòu)建 （1）真核細(xì)胞表達(dá)載體pEGFP-N1經(jīng)過限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BglⅡ雙酶切后，其酶切結(jié)果的條帶位于marker的4000-5000bp之間，與長度約為4713bp的pEGFP-N1基本吻合；合成質(zhì)粒MMP-3經(jīng)過限制性內(nèi)切酶XHOⅠ和BglⅡ進(jìn)行雙酶切后，其酶切結(jié)果條帶有兩條，一個位于2500-3000bp之間，與長度約為2692bp合成質(zhì)粒MMP-3的載體pMD18-T_simple_Vector基本相符，另一個條帶位于1200-1500bp之間，與長度約為1434bp的目的片段MMP-3基本吻合。 （2）重組質(zhì)粒pEGFP-N1-MMP-3經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，可見質(zhì)粒條帶亮度較高，表示其濃度高，可以用于轉(zhuǎn)染。經(jīng)過EcoRⅠ和BglⅡ雙酶切后，其酶切結(jié)果可見兩個條帶，一個位于4000-5000bp之間，另一個位于1200-1500bp之間，分別代表pEGFP-N1與MMP-3。 （3）將生物公司的測序結(jié)果與GenBank中的人基質(zhì)金屬蛋白酶基因序列用JellyFish1.3軟件分析比對,相似性達(dá)99.6%。 2.原代細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 （1）培養(yǎng)至3-5天后在40倍鏡下觀察可見散在的細(xì)胞簇；10天左右100倍鏡下觀察可見細(xì)胞逐漸融合成片；約2周左右，細(xì)胞全部融合。 （2）晶狀體上皮細(xì)胞中MMP-3的表達(dá)：對照組細(xì)胞在普通光鏡鏡下可見，細(xì)胞鑲嵌排列，無色，折光性強(qiáng)，熒光顯微鏡下未見GFP熒光；轉(zhuǎn)染組細(xì)胞在普通光鏡下可見細(xì)胞呈不規(guī)則多角形，無色，折光性強(qiáng)，熒光顯微鏡下可見成功轉(zhuǎn)染上重組質(zhì)粒的細(xì)胞發(fā)出綠色熒光。 （3）以ImageJ1.44軟件經(jīng)灰度分析western blot結(jié)果可見，對照中的Fibronectin蛋白表達(dá)量明顯高于轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞。 （4）與對照組細(xì)胞FN的表達(dá)量相比，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的FN表達(dá)量降低，差異有顯著性（P＜0.05）。 結(jié)論 1.目的片段MMP-3可以以pEGFP-N1作為載體構(gòu)建真核重組質(zhì)粒。 2．晶狀體上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)過程中，細(xì)胞生長較為活躍。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后，細(xì)胞可以表達(dá)MMP-3蛋白。對照組與轉(zhuǎn)染組中Fibronectin蛋白的表達(dá)量差異，對照組Fibronectin表達(dá)量高于轉(zhuǎn)染組，而MMP-3的作用之一即為降解包括纖維粘連蛋白在內(nèi)的胞外基質(zhì)，進(jìn)一步證實(shí)MMP-3蛋白表達(dá)的成功，及其生理作用的正常發(fā)揮。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R776.1

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 張自峰;張健;周健;惠延年;惠玲;劉新平;藥立波;王雨生;崔志利;;穩(wěn)定表達(dá)MRG15基因的人晶狀體上皮細(xì)胞株的建立[J];國際眼科雜志;2006年03期

2 丁芝祥;譚淺;劉雙珍;劉丹;李忠慶;彭建強(qiáng);;HSV1-TK基因重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建及表達(dá)[J];中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2008年03期

3 牛嗣云,高福祿,潘林潔,王春燕,王玉平,龐小靜;TGF-β_1、EGF在人胎兒晶狀體上皮細(xì)胞的表達(dá)[J];承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2000年03期

4 翁景寧,張惠蓉;PCNA反義寡脫氧核苷酸對牛晶狀體上皮細(xì)胞體外增殖活性的影響[J];眼科研究;2001年03期

5 劉寶海,譚少健,韋敏怡,梁皓,李霞,蔣林志;γ干擾素對兔晶狀體上皮細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)的影響[J];眼科;2004年05期

6 譚健,姚克,王凱軍,徐雯,申屠形超;環(huán)孢素A對兔晶狀體上皮細(xì)胞增殖的影響[J];眼科研究;2005年02期

7 譚淺,羅棟強(qiáng),蔣劍;骨橋蛋白在白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá)[J];國際眼科雜志;2005年04期

8 張雪巖,張勁松,孔瑋;人晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)熱休克蛋白mRNA的表達(dá)[J];眼科新進(jìn)展;2005年05期

9 崔t熈

本文編號：2281603