【摘要】：觀察脯氨酸羥化酶2(prolyl hydroxylase domain 2, PHD2)和內(nèi)臟脂肪素(visfatin)在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的表達情況,發(fā)現(xiàn)早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中PHD2和visfatin呈高表達,揭示了PHD2和visfatin在糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生發(fā)展過程中可能起重要作用。通過探討在糖尿病視網(wǎng)膜病變動物模型中PHD2和visfatin的作用機制,尋找糖尿病視網(wǎng)膜病變治療的新靶點。第一部分 脯氨酸羥化酶2在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的表達及意義目的觀察脯氨酸羥化酶2 (prolyl hydroxylase domain 2, PHD2)在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的表達情況,探討在糖尿病視網(wǎng)膜病變動物模型中PHD2的作用機制,尋找糖尿病視網(wǎng)膜病變治療的新靶點。方法 (1)早期糖尿病動物模型的制作：采用0.001mmol/L檸檬酸鹽緩沖液配成10g/L的鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ),實驗組大鼠45只,對照組大鼠15只,按60mg/kg劑量在大鼠左下腹腔內(nèi)注射,72h后取大鼠尾血測血糖。將血糖≥16.7mmol/L的大鼠確定為糖尿病大鼠的模型,對照組大鼠腹腔注射檸檬酸鹽緩沖液。(2)建模成功的糖尿病大鼠定期檢測血糖和測量體重,并記錄。建立模型8w后對眼部標本進行病理切片,行免疫熒光化學染色及蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining, HE),觀察大鼠視網(wǎng)膜組織的病理改變及PHD2、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)等因子在視網(wǎng)膜組織中的分布與表達情況,觀察PHD2主要表達于何種視網(wǎng)膜組織細胞,分析PHD2與其他血管增生因子的相關關系。(3)早期糖尿病大鼠眼內(nèi)因子mRNA表達檢測：應用RT-PCR方法檢測PHD2、VEGF、GFAP等因子mRNA在眼內(nèi)的表達情況。結果(1)糖尿病大鼠的體重隨時間推移先增后減,血糖始終維持在高水平,與對照組比較,有統(tǒng)計學意義(p0.01)(2)視網(wǎng)膜冰凍切片HE染色結果：光鏡下糖尿病大鼠組視網(wǎng)膜各層增厚,排列紊亂,部分血管呈擴張趨勢,并可見色素上皮細胞增生。與糖尿病大鼠組相比,正常對照組大鼠可見視網(wǎng)膜組織表面光滑,各層結構清晰完整,細胞排列整齊。(3)免疫熒光染色：在正常大鼠視網(wǎng)膜中,PHD2不表達,GFAP及VEGF主要在星形膠質細胞中表達,其余各層組織不表達；但在早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜全層中可見PHD2、GFAP及VEGF染色均為強陽性,以神經(jīng)膠質細胞表達為主,PHD2與VEGF和GFAP共表達。(4)實驗組PHD2、GFAP及VEGF mRNA表達水平較正常對照組明顯增高,差異有統(tǒng)計學意義(p0.01)。結論早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中PHD2呈高表達可能由局部高濃度血糖誘導神經(jīng)膠質細胞分泌產(chǎn)生,進而促進VEGF、GFAP的表達增高,PHD2在糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生發(fā)展過程中可能起重要作用。第二部分 內(nèi)臟脂肪素和血管內(nèi)皮生長因子在早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的表達及意義目的觀察內(nèi)臟脂肪素(visfatin)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial factor, VEGF)在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的分布特點和表達情況,探討visfatin和VEGF在糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)動物模型中的作用機制,尋找糖尿病視網(wǎng)膜病變治療的新靶點。方法 (1)早期糖尿病動物模型的制作：將60只雄性SPF級SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為糖尿病組和對照組各30只。采用0.001mmol/L檸檬酸鹽緩沖液配成10g/L的鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ),糖尿病組大鼠腹腔一次性注射鏈脲佐菌素60 mg/kg (0.60 ml/100g)誘導糖尿病大鼠模型,血糖≥16.7mmol/L為造模成功,對照組以同樣的方法注射等容量檸檬酸鈉緩沖液。(2)建模成功的糖尿病大鼠定期檢測血糖和測量體重,并記錄。于模型建立后8w處死大鼠并提取視網(wǎng)膜組織,采用免疫熒光法和Western blot法分別從形態(tài)學和分子生物學水平觀察及檢測visfatin和VEGF在視網(wǎng)膜中的表達情況。結果 (1)造模后8w糖尿病組大鼠平均體質量為(189±11)g,明顯低于對照組的(489±14)g,差異有統(tǒng)計學意義(t=5.236,P=0.003)；造模后8w糖尿病大鼠血糖水平為(29.25±3.86)mmol/L,明顯高于對照組的(5.32±1.01)mmol/L,差異有統(tǒng)計學意義(t=11.778,P=0.000)。(2)免疫熒光雙標法檢測顯示,對照組大鼠視網(wǎng)膜中visfatin和VEGF主要在視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層和星形膠質細胞呈中少量表達,但在早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜全層中可見visfatin及VEGF強陽性染色,且二者呈共表達。(3)Western blot檢測顯示,造模后8w糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中visfatin表達水平(A值)為346.26±41.23,對照組為102.07±65.01,差異有統(tǒng)計學意義(t=8.291,P=0.000)；造模后8w糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜中VEGF蛋白表達量(A值)為415.88±92.15,明顯高于對照組大鼠的113.06±32.06,差異有統(tǒng)計學意義(t=10.067,P=0.000)。結論早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中visfatin呈高表達,提示visfatin在糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生發(fā)展過程中可能起關鍵作用,其機制可能與局部高糖低氧誘導Mtiller細胞分泌產(chǎn)生,進而上調VEGF的表達所致。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R587.2;R774.1

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本文編號：2270118