【摘要】：第一部分聲預處理對急性聲損傷的保護作用及耳蝸形態(tài)學改變的影響目的:通過建立聲預處理和急性聲損傷SD大鼠動物模型,明確聲預處理對大鼠聽力的保護作用及其對急性聲損傷所致耳蝸組織細胞結構變化的影響。方法:將20只健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠按照完全隨機分組的原則,分為四組即:正常對照組(Ctrl,5只)、聲預處理組(SC,5只)、噪聲暴露組(NE,5只)和聲預處理+噪聲暴露組(SC+NE,5只)。其中噪聲暴露組給予聲強為115d B SPL白噪聲每天6小時,連續(xù)兩天;聲預處理組給予聲強為85d B SPL純音500Hz 24小時;聲預處理+噪聲暴露組則在先后給予聲預處理和噪聲暴露之間休息3小時;正常對照組不給予任何噪聲接觸,但其他方面均與造模組相同。于造模前以及造模后1天,分別采用ABR聽性腦干反應(auditory brainstem response)檢測SD大鼠雙耳聽覺反應閾值,在聽覺功能上觀察聲預處理和噪聲暴露對大鼠聽力的影響。遂后采用基底膜鋪片鬼筆環(huán)肽染色激光共聚焦和掃描電鏡觀察不同組SD大鼠耳蝸各轉毛細胞形態(tài)變化,在形態(tài)學上證實聲預處理和噪聲暴露對SD大鼠耳蝸外毛細胞結構的影響;同時常規(guī)透射電鏡觀察各組大鼠耳蝸軸螺旋神經(jīng)元細胞超微結構變化,在形態(tài)學上證實聲預處理和噪聲暴露對SD大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)元細胞線粒體結構的影響。結果:聽覺腦干誘發(fā)電位(ABR)Click聲和純音檢測聽力閾值,結果均顯示噪聲暴露前給予聲預處理的大鼠聽閾明顯低于單純噪聲暴露的大鼠聽閾,且兩者聽閾差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),而造模后聲預處理組和正常組兩者聽閾在統(tǒng)計學上未見明顯差異(P0.05)�；啄や伷砉P環(huán)肽染色和掃描電鏡均證實了聲預處理對各轉三排外毛細胞功能性的結構重塑,即:底轉三排外毛細胞結構完整,纖毛變短變粗且方向一致;中轉、頂轉三排外毛細胞纖毛極性消失,排列不齊且松散,有少量出現(xiàn)纖毛排列紊亂,但無明顯纖毛倒伏、融合和消失;并且與單純噪聲暴露相比,噪聲暴露前給予聲預處理其各轉三排外毛細胞缺失明顯減少,外毛細胞纖毛變短但排列尚整齊,無明顯纖毛倒伏、融合和消失;外毛細胞計數(shù)表明噪聲暴露前給予聲預處理在底轉、中轉外毛細胞缺失率上明顯低于單純噪聲暴露,且兩者差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05),但兩者在頂轉外毛細胞缺失率未見明顯統(tǒng)計學差異(P0.05)。另外,透射電鏡觀察證實聲預處理后耳蝸軸螺旋神經(jīng)元細胞結構正常,線粒體數(shù)量有所增加,線粒體Qg嵴電子密度增高,內嵴間隙明顯變窄;而噪聲暴露后耳蝸軸螺旋神經(jīng)元細胞皺縮,與鞘膜出現(xiàn)分離,線粒體腫脹變形且數(shù)量減少,Qg嵴電子密度降低,出現(xiàn)斷裂、融合、消失,Qg嵴間隙明顯增寬,大量空泡形成;同時較單純噪聲暴露,噪聲暴露前給予聲預處理其耳蝸軸螺旋神經(jīng)元細胞皺縮和分離不明顯,線粒體無明顯腫脹變形,Qg嵴結構完整且電子密度增高,內嵴間隙明顯變窄,未見Qg嵴斷裂、融合、消失,偶有空泡形成。同時,耳蝸螺旋神經(jīng)元細胞線粒體計數(shù)表明噪聲暴露后螺旋神經(jīng)元細胞線粒體密度明顯減小(P0.05),而聲預處理后螺旋神經(jīng)元細胞線粒體密度有明顯增加(P0.05)。結論:聲預處理對大鼠急性聲損傷有一定的聽力保護作用,且對大鼠聽力無明顯損傷。在形態(tài)學上,聲預處理對噪聲暴露所致大鼠底轉、中轉外毛細胞損傷有一定保護作用;但對大鼠頂轉外毛細胞損傷保護作用不明顯。另外,噪聲暴露破壞了線粒體的結構,對螺旋神經(jīng)元細胞線粒體功能有明顯損傷作用,而聲預處理可明顯提高線粒體的數(shù)量和功能狀態(tài),在一定程度上抑制了噪聲暴露對螺旋神經(jīng)元細胞線粒體的損傷和破壞。第二部分聲預處理保護作用分子機制的在體研究目的:闡明聲預處理通過調節(jié)螺旋神經(jīng)元細胞線粒體結構和提高線粒體功能狀態(tài)發(fā)揮保護作用的可能分子機制,從而指導臨床急性聲損傷的聲預處理治療,并提供新的思路和理論支持。方法:將80只健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠按照完全隨機分組的原則,分為四組即:正常對照組(Ctrl,20只)、聲預處理組(SC,20只)、噪聲暴露組(NE,20只)和聲預處理+噪聲暴露組(SC+NE,20只)。其中噪聲暴露組給予聲強為115d B SPL白噪聲每天6小時,連續(xù)兩天;聲預處理組給予聲強為85d B SPL純音500Hz 24小時;聲預處理+噪聲暴露組則在前后給予聲預處理和噪聲暴露之間休息3小時;正常對照組不給予任何噪聲接觸,但其他方面均與造模組相同。造模后采用RT-PCR、免疫熒光染色和Western blot蛋白印跡方法分別檢測各組SD大鼠Hsp70、Bmi1、SOD1、SOD2 m RNA和蛋白表達以及AKT蛋白磷酸化水平變化。結果:免疫熒光染色和Western blot蛋白印跡結果顯示:Hsp70蛋白在正常螺旋神經(jīng)節(jié)細胞(包括螺旋神經(jīng)元細胞和支持細胞)中均有一定程度表達;噪聲暴露降低了螺旋神經(jīng)元細胞Hsp70蛋白表達,但其周圍的支持細胞可以部分代償性維持Hsp70蛋白表達;而聲預處理能明顯提高螺旋神經(jīng)元細胞Hsp70蛋白表達,在一定程度上抑制了噪聲暴露對螺旋神經(jīng)元細胞Hsp70蛋白表達的下調。而Bmi1蛋白在正常螺旋神經(jīng)節(jié)細胞(包括螺旋神經(jīng)元細胞和支持細胞)中亦均有一定程度表達,噪聲暴露降低了螺旋神經(jīng)元細胞Bmi1蛋白表達,但其周圍的支持細胞卻代償性提高Bmi1蛋白表達;而聲預處理亦能明顯提高螺旋神經(jīng)節(jié)細胞Bmi1蛋白表達并轉位于線粒體內,在一定程度上可以抑制噪聲暴露對螺旋神經(jīng)元細胞Bmi1蛋白表達的下調,這與Hsp70表達具有時間和空間上的一致性。另外,SOD1、SOD2蛋白在正常螺旋神經(jīng)節(jié)細胞(包括螺旋神經(jīng)元細胞和支持細胞)中亦均有一定程度表達;噪聲暴露降低了螺旋神經(jīng)元細胞和支持細胞SOD1、SOD2蛋白表達;而聲預處理亦能明顯提高螺旋神經(jīng)節(jié)細胞SOD1、SOD2蛋白表達,在一定程度上可以抑制噪聲暴露對螺旋神經(jīng)節(jié)細胞SOD1、SOD2蛋白表達的下調。同時RT-PCR結果顯示:較正常對照組,聲預處理組螺旋神經(jīng)節(jié)細胞Hsp70、Bmi1、SOD1和SOD2 m RNA表達均明顯提高。結論:聲預處理誘導上調螺旋神經(jīng)元細胞Hsp70 m RNA和蛋白表達,增強了神經(jīng)元細胞自身的保護性應激反應;同時螺旋神經(jīng)元細胞Bmi1、SOD1和SOD2的m RNA和蛋白表達的上調及Bmi1蛋白的線粒體轉位也參與了聲預處理對噪聲暴露所致急性聲損傷的保護作用,其中誘導抗氧化基因SOD1和SOD2蛋白表達上調與Hsp70和Bmi1蛋白表達上調均具有時間和空間上的一致性。第三部分相關分子機制的體外研究目的:為進一步證實聲預處理可能激活的分子調控機制,闡明螺旋神經(jīng)元細胞抗氧化基因SOD1和SOD2可能是Hsp70和Bmi1的下游調控分子靶點。方法:新生SD大鼠仔鼠耳蝸螺旋神經(jīng)元細胞取材培養(yǎng)1天后,完全隨機分為:正常對照組和Bmi1抑制劑組,其中正常對照組除按需更換細胞培養(yǎng)液外加入與抑制劑組相同體積的DMSO溶液,而Bmi1抑制劑組除按需更換細胞培養(yǎng)液外加入1μM PTC-209溶液(DMSO為溶劑);培養(yǎng)兩天后細胞爬片免疫熒光染色并熒光顯微鏡觀察各組體外培養(yǎng)大鼠螺旋神經(jīng)元細胞Bmi1、SOD1、SOD2和Hsp70的表達變化。結果:Bmi1高選擇性抑制劑PTC-209與新生大鼠螺旋神經(jīng)元細胞體外共培養(yǎng),免疫熒光染色觀察,結果顯示:在PTC-209抑制劑有效抑制Bmi1蛋白表達的前提下,與正常螺旋神經(jīng)元細胞相比,其胞體內紅色熒光標記的SOD1和SOD2表達均顯著減少,而其胞體QgHsp70蛋白仍為弱陽性表達;這表明大鼠螺旋神經(jīng)元細胞Bmi1正性調控了SOD1和SOD2蛋白的表達,但并不調控Hsp70蛋白表達。結論:螺旋神經(jīng)元細胞抗氧化基因SOD1和SOD2可能是Bmi1的下游調控分子靶點。
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【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R764

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本文編號：2269184