【摘要】：第一部分聲預(yù)處理對急性聲損傷的保護(hù)作用及耳蝸形態(tài)學(xué)改變的影響目的:通過建立聲預(yù)處理和急性聲損傷SD大鼠動物模型,明確聲預(yù)處理對大鼠聽力的保護(hù)作用及其對急性聲損傷所致耳蝸組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化的影響。方法:將20只健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠按照完全隨機(jī)分組的原則,分為四組即:正常對照組(Ctrl,5只)、聲預(yù)處理組(SC,5只)、噪聲暴露組(NE,5只)和聲預(yù)處理+噪聲暴露組(SC+NE,5只)。其中噪聲暴露組給予聲強(qiáng)為115d B SPL白噪聲每天6小時,連續(xù)兩天;聲預(yù)處理組給予聲強(qiáng)為85d B SPL純音500Hz 24小時;聲預(yù)處理+噪聲暴露組則在先后給予聲預(yù)處理和噪聲暴露之間休息3小時;正常對照組不給予任何噪聲接觸,但其他方面均與造模組相同。于造模前以及造模后1天,分別采用ABR聽性腦干反應(yīng)(auditory brainstem response)檢測SD大鼠雙耳聽覺反應(yīng)閾值,在聽覺功能上觀察聲預(yù)處理和噪聲暴露對大鼠聽力的影響。遂后采用基底膜鋪片鬼筆環(huán)肽染色激光共聚焦和掃描電鏡觀察不同組SD大鼠耳蝸各轉(zhuǎn)毛細(xì)胞形態(tài)變化,在形態(tài)學(xué)上證實(shí)聲預(yù)處理和噪聲暴露對SD大鼠耳蝸外毛細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響;同時常規(guī)透射電鏡觀察各組大鼠耳蝸軸螺旋神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化,在形態(tài)學(xué)上證實(shí)聲預(yù)處理和噪聲暴露對SD大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)元細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果:聽覺腦干誘發(fā)電位(ABR)Click聲和純音檢測聽力閾值,結(jié)果均顯示噪聲暴露前給予聲預(yù)處理的大鼠聽閾明顯低于單純噪聲暴露的大鼠聽閾,且兩者聽閾差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而造模后聲預(yù)處理組和正常組兩者聽閾在統(tǒng)計學(xué)上未見明顯差異(P0.05)�；啄や伷砉P環(huán)肽染色和掃描電鏡均證實(shí)了聲預(yù)處理對各轉(zhuǎn)三排外毛細(xì)胞功能性的結(jié)構(gòu)重塑,即:底轉(zhuǎn)三排外毛細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,纖毛變短變粗且方向一致;中轉(zhuǎn)、頂轉(zhuǎn)三排外毛細(xì)胞纖毛極性消失,排列不齊且松散,有少量出現(xiàn)纖毛排列紊亂,但無明顯纖毛倒伏、融合和消失;并且與單純噪聲暴露相比,噪聲暴露前給予聲預(yù)處理其各轉(zhuǎn)三排外毛細(xì)胞缺失明顯減少,外毛細(xì)胞纖毛變短但排列尚整齊,無明顯纖毛倒伏、融合和消失;外毛細(xì)胞計數(shù)表明噪聲暴露前給予聲預(yù)處理在底轉(zhuǎn)、中轉(zhuǎn)外毛細(xì)胞缺失率上明顯低于單純噪聲暴露,且兩者差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),但兩者在頂轉(zhuǎn)外毛細(xì)胞缺失率未見明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。另外,透射電鏡觀察證實(shí)聲預(yù)處理后耳蝸軸螺旋神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常,線粒體數(shù)量有所增加,線粒體Qg嵴電子密度增高,內(nèi)嵴間隙明顯變窄;而噪聲暴露后耳蝸軸螺旋神經(jīng)元細(xì)胞皺縮,與鞘膜出現(xiàn)分離,線粒體腫脹變形且數(shù)量減少,Qg嵴電子密度降低,出現(xiàn)斷裂、融合、消失,Qg嵴間隙明顯增寬,大量空泡形成;同時較單純噪聲暴露,噪聲暴露前給予聲預(yù)處理其耳蝸軸螺旋神經(jīng)元細(xì)胞皺縮和分離不明顯,線粒體無明顯腫脹變形,Qg嵴結(jié)構(gòu)完整且電子密度增高,內(nèi)嵴間隙明顯變窄,未見Qg嵴斷裂、融合、消失,偶有空泡形成。同時,耳蝸螺旋神經(jīng)元細(xì)胞線粒體計數(shù)表明噪聲暴露后螺旋神經(jīng)元細(xì)胞線粒體密度明顯減小(P0.05),而聲預(yù)處理后螺旋神經(jīng)元細(xì)胞線粒體密度有明顯增加(P0.05)。結(jié)論:聲預(yù)處理對大鼠急性聲損傷有一定的聽力保護(hù)作用,且對大鼠聽力無明顯損傷。在形態(tài)學(xué)上,聲預(yù)處理對噪聲暴露所致大鼠底轉(zhuǎn)、中轉(zhuǎn)外毛細(xì)胞損傷有一定保護(hù)作用;但對大鼠頂轉(zhuǎn)外毛細(xì)胞損傷保護(hù)作用不明顯。另外,噪聲暴露破壞了線粒體的結(jié)構(gòu),對螺旋神經(jīng)元細(xì)胞線粒體功能有明顯損傷作用,而聲預(yù)處理可明顯提高線粒體的數(shù)量和功能狀態(tài),在一定程度上抑制了噪聲暴露對螺旋神經(jīng)元細(xì)胞線粒體的損傷和破壞。第二部分聲預(yù)處理保護(hù)作用分子機(jī)制的在體研究目的:闡明聲預(yù)處理通過調(diào)節(jié)螺旋神經(jīng)元細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和提高線粒體功能狀態(tài)發(fā)揮保護(hù)作用的可能分子機(jī)制,從而指導(dǎo)臨床急性聲損傷的聲預(yù)處理治療,并提供新的思路和理論支持。方法:將80只健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠按照完全隨機(jī)分組的原則,分為四組即:正常對照組(Ctrl,20只)、聲預(yù)處理組(SC,20只)、噪聲暴露組(NE,20只)和聲預(yù)處理+噪聲暴露組(SC+NE,20只)。其中噪聲暴露組給予聲強(qiáng)為115d B SPL白噪聲每天6小時,連續(xù)兩天;聲預(yù)處理組給予聲強(qiáng)為85d B SPL純音500Hz 24小時;聲預(yù)處理+噪聲暴露組則在前后給予聲預(yù)處理和噪聲暴露之間休息3小時;正常對照組不給予任何噪聲接觸,但其他方面均與造模組相同。造模后采用RT-PCR、免疫熒光染色和Western blot蛋白印跡方法分別檢測各組SD大鼠Hsp70、Bmi1、SOD1、SOD2 m RNA和蛋白表達(dá)以及AKT蛋白磷酸化水平變化。結(jié)果:免疫熒光染色和Western blot蛋白印跡結(jié)果顯示:Hsp70蛋白在正常螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(包括螺旋神經(jīng)元細(xì)胞和支持細(xì)胞)中均有一定程度表達(dá);噪聲暴露降低了螺旋神經(jīng)元細(xì)胞Hsp70蛋白表達(dá),但其周圍的支持細(xì)胞可以部分代償性維持Hsp70蛋白表達(dá);而聲預(yù)處理能明顯提高螺旋神經(jīng)元細(xì)胞Hsp70蛋白表達(dá),在一定程度上抑制了噪聲暴露對螺旋神經(jīng)元細(xì)胞Hsp70蛋白表達(dá)的下調(diào)。而Bmi1蛋白在正常螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(包括螺旋神經(jīng)元細(xì)胞和支持細(xì)胞)中亦均有一定程度表達(dá),噪聲暴露降低了螺旋神經(jīng)元細(xì)胞Bmi1蛋白表達(dá),但其周圍的支持細(xì)胞卻代償性提高Bmi1蛋白表達(dá);而聲預(yù)處理亦能明顯提高螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞Bmi1蛋白表達(dá)并轉(zhuǎn)位于線粒體內(nèi),在一定程度上可以抑制噪聲暴露對螺旋神經(jīng)元細(xì)胞Bmi1蛋白表達(dá)的下調(diào),這與Hsp70表達(dá)具有時間和空間上的一致性。另外,SOD1、SOD2蛋白在正常螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(包括螺旋神經(jīng)元細(xì)胞和支持細(xì)胞)中亦均有一定程度表達(dá);噪聲暴露降低了螺旋神經(jīng)元細(xì)胞和支持細(xì)胞SOD1、SOD2蛋白表達(dá);而聲預(yù)處理亦能明顯提高螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞SOD1、SOD2蛋白表達(dá),在一定程度上可以抑制噪聲暴露對螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞SOD1、SOD2蛋白表達(dá)的下調(diào)。同時RT-PCR結(jié)果顯示:較正常對照組,聲預(yù)處理組螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞Hsp70、Bmi1、SOD1和SOD2 m RNA表達(dá)均明顯提高。結(jié)論:聲預(yù)處理誘導(dǎo)上調(diào)螺旋神經(jīng)元細(xì)胞Hsp70 m RNA和蛋白表達(dá),增強(qiáng)了神經(jīng)元細(xì)胞自身的保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng);同時螺旋神經(jīng)元細(xì)胞Bmi1、SOD1和SOD2的m RNA和蛋白表達(dá)的上調(diào)及Bmi1蛋白的線粒體轉(zhuǎn)位也參與了聲預(yù)處理對噪聲暴露所致急性聲損傷的保護(hù)作用,其中誘導(dǎo)抗氧化基因SOD1和SOD2蛋白表達(dá)上調(diào)與Hsp70和Bmi1蛋白表達(dá)上調(diào)均具有時間和空間上的一致性。第三部分相關(guān)分子機(jī)制的體外研究目的:為進(jìn)一步證實(shí)聲預(yù)處理可能激活的分子調(diào)控機(jī)制,闡明螺旋神經(jīng)元細(xì)胞抗氧化基因SOD1和SOD2可能是Hsp70和Bmi1的下游調(diào)控分子靶點(diǎn)。方法:新生SD大鼠仔鼠耳蝸螺旋神經(jīng)元細(xì)胞取材培養(yǎng)1天后,完全隨機(jī)分為:正常對照組和Bmi1抑制劑組,其中正常對照組除按需更換細(xì)胞培養(yǎng)液外加入與抑制劑組相同體積的DMSO溶液,而Bmi1抑制劑組除按需更換細(xì)胞培養(yǎng)液外加入1μM PTC-209溶液(DMSO為溶劑);培養(yǎng)兩天后細(xì)胞爬片免疫熒光染色并熒光顯微鏡觀察各組體外培養(yǎng)大鼠螺旋神經(jīng)元細(xì)胞Bmi1、SOD1、SOD2和Hsp70的表達(dá)變化。結(jié)果:Bmi1高選擇性抑制劑PTC-209與新生大鼠螺旋神經(jīng)元細(xì)胞體外共培養(yǎng),免疫熒光染色觀察,結(jié)果顯示:在PTC-209抑制劑有效抑制Bmi1蛋白表達(dá)的前提下,與正常螺旋神經(jīng)元細(xì)胞相比,其胞體內(nèi)紅色熒光標(biāo)記的SOD1和SOD2表達(dá)均顯著減少,而其胞體QgHsp70蛋白仍為弱陽性表達(dá);這表明大鼠螺旋神經(jīng)元細(xì)胞Bmi1正性調(diào)控了SOD1和SOD2蛋白的表達(dá),但并不調(diào)控Hsp70蛋白表達(dá)。結(jié)論:螺旋神經(jīng)元細(xì)胞抗氧化基因SOD1和SOD2可能是Bmi1的下游調(diào)控分子靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R764

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本文編號：2269184