【摘要】：中耳膽脂瘤是一種在中耳和乳突腔內的非腫瘤的疾病,其病理學特征包括鱗狀上皮角化功能受損、上皮增生的同時伴有異常的上皮內細微結構的變化如微膽脂瘤的形成、基底膜的破壞、斷裂,膽脂瘤上皮下組織炎性細胞的浸潤等。臨床表現(xiàn)主要有耳痛、流膿、聽力下降,嚴重的可波及面神經引起面癱、波及半規(guī)管導致眩暈及顱內外的感染危及生命,而這一切的原因都是膽脂瘤對臨近骨質的破壞吸收所致。目前膽脂瘤發(fā)生發(fā)展的機制尚不明確。從分子生物學上研究發(fā)現(xiàn)多種因素,如增生、凋亡、分化、炎癥、感染、骨質破壞、脂類代謝、血管發(fā)生在膽脂瘤的形成和臨床表現(xiàn)方面有著一定的作用,其中增生、分化和凋亡的異常表現(xiàn)是膽脂瘤上皮的最基本特征。研究多以與正常皮膚上皮的生物學特性相比較,發(fā)現(xiàn)膽脂瘤上皮增殖的能力異常增高,這種高度的增殖同腫瘤細胞是類似的已達成共識,目前分歧最大的地方是關于凋亡,包括凋亡能力、凋亡發(fā)生的途徑及凋亡的意義。細胞凋亡(apoptosis)是一種自主性死亡過程,由特定基因控制,在多種病理生理過程中是不可缺少的。一些學者認為膽脂瘤上皮細胞的凋亡能力增加,過度凋亡導致的膽脂瘤上皮脫落形成的角化物的聚集同膽脂瘤的發(fā)生發(fā)展有關,而且凋亡水平的變化同膽脂瘤的骨質吸收與復發(fā)、殘留有關,而另一些研究的結果則傾向于膽脂瘤上皮細胞中凋亡能力受到了阻滯,導致凋亡周期延長,細胞存在抗凋亡(anti-apoptosis)作用。研究發(fā)現(xiàn),細胞增殖、分化和死亡、遷移等多種生物學過程均受一類長20-30nt的小RNA分子即Micro(mi)RNA的調控,mi RNA可以通過沉默其靶基因表達來發(fā)揮調控作用,其作用方式是與靶基因m RNA3’端非翻譯區(qū)里的特異的結合位點結合。多項研究表明,腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預后同mi RNA的作用密切相關,同時mi RNA在多種異常增生性疾病和代謝性疾病中也發(fā)生了明顯的變化。Friedland等以耳后皮膚組織為對照,采用RT-PCR技術首次檢測到八種mi RNAs在膽脂瘤組織中的表達發(fā)生上調,其中mi RNA-21的表達量改變最高,平均高于對照組4.4倍,其下游靶基因為PTEN和PDCD。2011年陳曉華研究了膽脂瘤上皮增殖和凋亡的相互關系,結果發(fā)現(xiàn),凋亡相關mi RNA(apoptotic-associated mi RNA)let-7a在膽脂瘤上皮表達上調。Let-7 micro RNA家族是目前研究最廣泛的micro RNA之一,在調控細胞的增殖和凋亡方面均有作用途徑參與。在大多數(shù)腫瘤呈現(xiàn)低表達,提示let-7 micro RNA的功能抑制與腫瘤的凋亡能力下降密切相關,而其在膽脂瘤中的高表達提示其對膽脂瘤細胞的調控模式顯然不同于在腫瘤細胞中的作用方式。2015年張文靜從Let-7a micro RNA對膽脂瘤細胞增生的影響進行研究,發(fā)現(xiàn)Let-7a micro RNA通過抑制mi RNA-21的作用而影響了細胞的增生,然而從mi RNA水平研究膽脂瘤凋亡以及l(fā)et-7 micro RNA參與中耳膽脂瘤凋亡的調控作用及具體途徑的研究國內外尚未見報道。相對于成人膽脂瘤來說,小兒膽脂瘤通常具有更強的攻擊性、侵襲性和復發(fā)性,既往研究表明凋亡的差異與膽脂瘤骨質破壞、復發(fā)有關,因而凋亡在上述兩種膽脂瘤中的表現(xiàn)有無差異以及mi RNA在其中起到的作用如何值得進一步研究。本研究目的1.觀察兒童膽脂瘤和成人膽脂瘤的凋亡能力的差異以及mi RNA-let-7c及其靶蛋白Bcl-xl在兩種膽脂瘤中的表達情況,研究mi RNA-let-7c與凋亡在膽脂瘤發(fā)生中的作用。2.以攜帶mi RNA-let-7c抑制體的慢病毒載體感染培養(yǎng)的膽脂瘤上皮角質細胞,觀察下調mi RNA-let-7c對膽脂瘤角質細胞中mi RNA-let-7c及其靶基因Bcl-xl表達情況以及對細胞凋亡能力的影響。3.觀察mi RNA-let-7c inhibitor干擾膽脂瘤細胞凋亡的具體途徑,以期闡明膽脂瘤中mi RNA-let-7c介導凋亡的發(fā)生機制,為我們認識mi RNA在中耳膽脂瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用提供新的理論依據。第一部分mi RNA-let-7c在兒童膽脂瘤和成人膽脂瘤組織中的表達研究方法1.利用TUNEL法檢測29例兒童中耳膽脂瘤(年齡≤14歲)、29例成人中耳膽脂瘤(年齡≥18歲)的凋亡的差異,同時以相應的兒童、成人耳后正常皮膚組織作為對照。2.提取29例成人膽脂瘤組織、29例兒童膽脂瘤組織和耳后皮膚組織中的m RNAs,其濃度和純度的檢測通過紫外分光光度儀獲得。3.利用RT-PCR技術檢測兒童膽脂瘤、成人膽脂瘤組織和其對照組中mi RNA-let-7c的表達。4.采用免疫印跡技術檢測中耳膽脂瘤組織及對照組中Bcl-xl蛋白的表達。結果1.膽脂瘤上皮的凋亡同耳后皮膚組織相比,凋亡顯著高于皮膚組(P0.05);成人中耳膽脂瘤上皮的凋亡能力高于兒童膽脂瘤(P0.05);兩組耳后正常皮膚組織間的凋亡無差異(P0.05)。2.成人膽脂瘤組織中mi RNA-let-7c的表達是對照組的11.96±0.09倍(P0.05);兒童膽脂瘤組織中mi RNA-let-7c的表達是對照組的7.94±0.04倍(P0.05);兒童和成人膽脂瘤間mi RNA-let-7c的表達差異也有統(tǒng)計學差異(P0.05);mi RNA-let-7c在兩組耳后皮膚上皮間的相對表達量無差異(P0.05)。3.Mi RNA-let-7c下游靶基因Bcl-xl在兩種膽脂瘤中均呈現(xiàn)低表達,在成人膽脂瘤中的表達更低(P0.05)。第二部分下調mi RNA-let-7c對膽脂瘤角質細胞中mi RNA-let-7c及其靶基因的表達以及細胞凋亡的影響方法1.采用兩步消化法獲取中耳膽脂瘤上皮角質細胞,在無血清培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。通過顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并進而利用角質細胞角蛋白抗體行免疫熒光化學方法檢測對角質細胞的性質進行鑒定。2.實驗分組:mi R-let-7c-inhibitor組(實驗組),mi R-let-7c-inhibitor NC組(陰性對照組),Mock組(空白對照組)。3.利用攜帶mi RNA-let-7c inhibitor的慢病毒載體和mi RNA-let-7c inhibitor NC的慢病毒載體感染膽脂瘤角質細胞,同時以空白對照組作為對照,培養(yǎng)后在熒光顯微鏡下觀察病毒感染效率,利用RT-PCR技術檢測mi RNA-let-7c的表達是否下調。4.利用western blotting和RT-PCR技術檢測mi R-let-7c inhibitor干擾對膽脂瘤角質細胞中Bcl-xl蛋白和m RNA表達的影響。5.將感染mi RNA-let-7c inhibitor慢病毒后的膽脂瘤角質細胞、陰性對照組和空白對照組細胞接種于96孔板中,共培養(yǎng)10天,每天取3孔通過檢測OD值,繪制生長曲線。6.如上方法處理膽脂瘤細胞96h后,三組細胞均進行碘化丙啶染色30分鐘后,用FCM法測定細胞凋亡及周期的改變。7.如上方法處理膽脂瘤細胞96h后利用Annexin V-FITC染色法觀察細胞早期凋亡狀況,TUNEL原位酶標記在熒光顯微鏡下觀察膽脂瘤細胞的凋亡。結果1.兩步消化法之后采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)可獲得足夠數(shù)量的膽脂瘤上皮角質細胞,利用角蛋白抗體檢測提取獲得的膽脂瘤角質上皮細胞的純度可達90%以上,可用于后續(xù)實驗。2.Mi R-let-7c-inhibitor組的膽脂瘤角質細胞中mi RNA-let-7c的表達顯著低于mi R-let-7c-NC組和Mock組,mi RNA-let-7c在mi R-let-7c-NC組中的表達是mi R-let-7c-inhibitor組的10.19±0.26倍,在Mock組中的表達是mi R-let-7c-inhibitor組的10.92±0.31倍,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05),而在mi R-let-7c-NC組和Mock組中的表達無差異(P0.05)。3.Bcl-xl蛋白在膽脂瘤角質細胞mi R-let-7c-inhibitor組的表達較mi R-let-7c-NC組和Mock組明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);在mi R-let-7c-NC組和Mock組中的表達無明顯差異(P0.05)。而Bcl-xl m RNA在mi R-let-7c-inhibitor組的表達同mi R-let-7c-NC組和Mock組相比無統(tǒng)計學差異(P0.05)。4.Mi RNA-let-7c inhibitor干擾后膽脂瘤上皮角質細胞生長速度較兩對照組明顯增快,第5天mi R-let-7c-inhibitor組的OD值與mi R-let-7c-NC組和Mock組比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),第9天時mi R-let-7c-inhibitor組因細胞密度過大,死亡細胞增多。5.Mi RNA-let-7c inhibitor感染膽脂瘤角質細胞96h后,凋亡細胞比例下降,同mi R-let-7c-NC組和Mock組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。細胞周期分布出現(xiàn)明顯改變,S期細胞的數(shù)量增多(P0.05),G0/G1期細胞比例的下降(P0.05),即mi RNA-let-7c inhibitor促使膽脂瘤角質細胞從G0/G1期進入S期。6.Mi RNA-let-7c inhibitor感染后96h,Annexin V-FITC檢測膽脂瘤角質細胞的早期凋亡率明顯減少(P0.05);TUNEL法檢測膽脂瘤角質細胞凋亡比例也明顯減少(P0.05)。第三部分mi RNA-let-7c參與膽脂瘤上皮角質細胞凋亡的分子機制研究方法1.利用western blotting檢測膽脂瘤組織及耳后皮膚組織中Bax、cytochrome C、smac、caspase-3和caspase-9的表達。2.利用攜帶mi RNA-let-7c inhibitor的慢病毒載體感染膽脂瘤角質細胞,實驗分組:mi R-let-7c-inhibitor組(實驗組),mi R-let-7c-NC組(陰性對照組),Mock組(空白對照組)。3.如上方法處理膽脂瘤細胞72小時后利用western blotting檢測mi R-let-7c inhibitor干擾對膽脂瘤角質細胞中線粒體凋亡途徑相關蛋白Bax、pro-caspase-3、pro-caspase-9和cytochrome C、Smac蛋白表達的影響。4.如上方法處理膽脂瘤細胞96小時后進行JC-1染色,之后檢測三組細胞線粒體膜電位的差異。5.如上方法處理膽脂瘤細胞96小時后利用分光光度儀檢測caspase-3和caspase-9的活性。結果1.膽脂瘤組織同耳后皮膚組織相比,Bax、cytochrome C、smac、caspase-3和caspase-9的表達均增加。2.Mi RNA-let-7c inhibitor感染膽脂瘤角質細胞72h后Bax、cytochrome C、Smac的表達明顯減少(P0.05),而pro-caspase-3、pro-caspase-9的表達明顯增加,差異有統(tǒng)計學差異(P0.05)。3.Mi RNA-let-7c inhibitor感染膽脂瘤角質細胞96h后線粒體膜電位檢測中綠色熒光值明顯下降,表明線粒體膜電位上升(P0.05)。4.Mi RNA-let-7c inhibitor感染膽脂瘤角質細胞96h后caspase-3和caspase-9的活性明顯降低(P0.05)。結論1.中耳膽脂瘤凋亡水平升高和mi RNA-let-7c的表達上調,從mi RNA水平驗證了膽脂瘤的高凋亡狀態(tài)的非腫瘤性質。2.Mi RNA-let-7c及其靶基因Bcl-xl和凋亡在兒童膽脂瘤和成人膽脂瘤中的表達有差異,這種差異提示兒童膽脂瘤的抗凋亡機制參與到了其發(fā)病機制中。3.Mi RNA-let-7c inhibitor慢病毒可有效沉默膽脂瘤角質細胞中mi RNA-let-7c的表達,通過在翻譯水平的負性調控機制使其靶基因Bcl-xl蛋白的表達升高。4.Mi R-let-7c通過阻斷細胞周期促進細胞凋亡,且以早中期細胞凋亡為主。5.Mi RNA-let-7c通過提高Bax/Bcl-xl比率,使線粒體膜電位降低,促進Cyt c、Smac釋放入胞漿進而激活一系列caspase蛋白酶通過線粒體途徑導致細胞凋亡。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R764.21

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 余其林,金康業(yè);中耳膽脂瘤上皮細胞增生與凋亡狀態(tài)的研究[J];臨床耳鼻咽喉科雜志;2001年10期

2 林刃輿,遲放魯;中耳膽脂瘤形成機理的研究進展[J];國外醫(yī)學.耳鼻咽喉科學分冊;2001年03期

3 劉志毅 ,張清利;中耳膽脂瘤誤診1例[J];陜西醫(yī)學雜志;2002年05期

4 魏雪梅;內鏡治療中耳膽脂瘤[J];國外醫(yī)學.耳鼻咽喉科學分冊;2002年03期

5 肖文惠,易自翔;后天性原發(fā)性中耳膽脂瘤的診治體會[J];中國耳鼻咽喉顱底外科雜志;2002年03期

6 陳學明;肖寬林;孫星海;;基質金屬蛋白酶-2在中耳膽脂瘤中的表達[J];中國眼耳鼻喉科雜志;2002年05期

7 李華清,楊清緒,廖艷萍,麥平青,朱全勝;腫瘤壞死因子-α在中耳膽脂瘤組織中的表達[J];醫(yī)藥論壇雜志;2003年14期

8 陳廣理,聶國輝,宋鵬,龔樹生;中耳膽脂瘤中熱休克蛋白70和細胞周期素依賴蛋白p~(27)的表達及病理意義[J];中華耳科學雜志;2003年02期

9 王輝兵,徐志文,唐安洲,蘇紀平;碳酸酐酶在中耳膽脂瘤上皮的表達[J];臨床耳鼻咽喉科雜志;2004年04期

10 陳雄,孔維佳;血管內皮生長因子在中耳膽脂瘤中的表達及其臨床意義[J];中華耳科學雜志;2004年02期

相關會議論文 前10條

1 苑鐵軍;韓在文;張鳳英;劉清明;;中耳膽脂瘤上皮高增殖性的新研究[A];中華醫(yī)學會全國中耳炎專題學術會議論文匯編[C];2004年

2 邢昌全;王華林;范國康;;改善聽力的一期中耳膽脂瘤手術[A];2005年浙江省耳鼻咽喉科學術會議論文匯編[C];2005年

3 黃琦;吳皓;陳向平;楊軍;汪照炎;;兒童中耳膽脂瘤16例臨床分析[A];中華醫(yī)學會第十次全國耳鼻咽喉-頭頸外科學術會議論文匯編（上）[C];2007年

4 徐潔;;腫瘤壞死因子受體1在中耳膽脂瘤上皮中的表達[A];中華醫(yī)學會第十次全國耳鼻咽喉-頭頸外科學術會議論文匯編（下）[C];2007年

5 李正賢;李學佩;施斐曼;;腫瘤壞死因子-α在中耳膽脂瘤中的表達[A];中國動物學會全國顯微與亞顯微形態(tài)科學分會第十次形態(tài)科學與顯微注射技術學術研討會論文摘要集[C];2000年

6 黎萬榮;陳正儂;;轉化生長因子α和β1在中耳膽脂瘤中的表達及其意義[A];中華醫(yī)學會全國中耳炎專題學術會議論文匯編[C];2004年

7 林刃輿;;中耳膽脂瘤上皮增殖過程中微血管密度可能的作用[A];華東六省一市耳鼻咽喉-頭頸外科學術會議暨2008年浙江省耳鼻咽喉-頭頸外科學術年會論文匯編[C];2008年

8 林刃輿;陳建福;;中耳膽脂瘤上皮增殖能力的研究[A];2007浙江省耳鼻咽喉—頭頸外科學術會議論文匯編[C];2007年

9 葉勝難;;破骨細胞在中耳膽脂瘤骨質破壞中的作用[A];華東六省一市耳鼻咽喉-頭頸外科學術會議暨2008年浙江省耳鼻咽喉-頭頸外科學術年會論文匯編[C];2008年

10 黃賽瑜;劉國鈞;項松潔;何秋香;;轉化生長因子α在中耳膽脂瘤形成中的作用初探[A];2005年浙江省耳鼻咽喉科學術會議論文匯編[C];2005年

相關重要報紙文章 前2條

1 主任 楊軍;中耳膽脂瘤摘除術后常感染化膿怎么辦[N];衛(wèi)生與生活報;2009年

2 王玉澤;中耳膽脂瘤應盡早手術[N];衛(wèi)生與生活報;2006年

相關博士學位論文 前3條

1 祝威;中耳膽脂瘤組織酶和癌基因異常表達的研究[D];吉林大學;2004年

2 劉偉;磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路在中耳膽脂瘤發(fā)病機制中的作用研究[D];中南大學;2012年

3 李楠;MicroRNA-let-7c對中耳膽脂瘤細胞凋亡的調控作用及分子機制研究[D];鄭州大學;2015年

相關碩士學位論文 前10條

1 李江華;中耳膽脂瘤組織中骨橋蛋白和基質金屬蛋白-9的表達和相關性研究[D];佳木斯大學;2008年

2 樓文蓉;人β防御素2在中耳膽脂瘤上皮中表達水平的研究[D];昆明醫(yī)學院;2009年

3 杜迎;核因子-κB在中耳膽脂瘤中的初步研究[D];昆明醫(yī)學院;2011年

4 冉鵬;增殖細胞核抗原與熱休克蛋白70在中耳膽脂瘤中的表達及意義[D];鄭州大學;2002年

5 楊小慶;中耳膽脂瘤上皮細胞的體外培養(yǎng)及增殖能力的初步研究[D];昆明醫(yī)科大學;2014年

6 廖軍;晚期糖基化終末產物受體與核因子-κβ在中耳膽脂瘤中的表達及意義[D];福建醫(yī)科大學;2014年

7 李愉宗;骨橋蛋白在中耳膽脂瘤上皮中的表達及臨床意義[D];暨南大學;2009年

8 陳浩;明膠酶及其抑制劑在中耳膽脂瘤中的表達及其意義[D];昆明醫(yī)學院;2005年

9 李楠;中耳膽脂瘤溶骨相關因素的研究[D];鄭州大學;2003年

10 劉佳;中耳膽脂瘤中核因子-κB表達的研究[D];昆明醫(yī)科大學;2012年

，

本文編號：2234114