【摘要】：目的:(1)研究PTX3在角膜上皮抗真菌固有免疫中的表達及規(guī)律。(2)研究Dectin-1/Syk和MAPKs信號通路是否參與了角膜上皮中PTX3的表達調(diào)控。(3)探討內(nèi)源性PTX3在角膜上皮抗真菌固有免疫中的作用及其可能的機制。方法:本研究分三部分進行研究。一、分別以真菌性角膜炎患者、真菌性角膜炎大鼠模型和體外培養(yǎng)的人角膜上皮細胞為研究對象,探討PTX3在真菌感染后的表達規(guī)律。采用熒光定量PCR檢測PTX3 mRNA的表達、免疫組織化學(xué)法或Western Blot檢測PTX3蛋白的表達。(1)選擇2013年5月到2015年10月在青島大學(xué)附屬醫(yī)院眼科確診為煙曲霉菌感染并行治療的角膜炎病人和正常供體的角膜標(biāo)本。收集病灶角膜的周邊角膜上皮組織作為感染組,健康角膜制作角膜移植片后剩余的周邊上皮組織作為正常對照。分別檢測在角膜煙曲霉菌感染前后PTX3 mRNA和蛋白的表達變化,利用免疫組織化學(xué)染色方法對PTX3蛋白在人角膜組織中的表達進行定位。同時,根據(jù)角膜潰瘍炎癥反應(yīng)程度對樣本進行分組(輕度、中度、重度),分析比較PTX3與真菌感染后不同程度炎癥反應(yīng)之間的關(guān)系。(2)將50只健康Wistar大鼠隨機分為3組:空白對照組、損傷對照組和真菌感染組,刮取角膜上皮檢測各組間PTX3在mRNA和蛋白水平的表達差異。(3)在體外培養(yǎng)的永生化人角膜上皮細胞(HCECs)中,用滅活的煙曲霉菌孢子抗原刺激體外培養(yǎng)的HCECs,建立煙曲霉菌感染的體外模型,檢測煙曲霉菌刺激不同時間后PTX3在基因和蛋白水平的表達規(guī)律。二、選取煙曲霉菌刺激下PTX3基因和蛋白水平表達最顯著的時間點(4h和8h),分別用Laminarin(Dectin-1阻斷劑)、Piceatannol(Syk抑制劑)、SB203580(p38MAPK抑制劑)、U0126-Et OH(MEK抑制劑)、SP600125(JNK抑制劑)預(yù)處理HCECs后,加入滅活煙曲霉菌孢子抗原混懸液,探究Dectin-1/Syk和MAPK信號通路是否參與了PTX3的表達調(diào)控。三、研究PTX3在角膜上皮抗煙曲霉菌固有免疫過程中被誘導(dǎo)產(chǎn)生后對炎癥的影響。在體外培養(yǎng)的人角膜上皮細胞中,利用PTX3 siRNA預(yù)處理HCECs阻斷內(nèi)源性PTX3的產(chǎn)生,再與煙曲霉菌孢子共同培養(yǎng),Western Blot檢測炎癥信號通路分子MAPKs蛋白總量和磷酸化水平的變化,熒光定量PCR和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)分別檢測終末炎癥因子IL-1β在mRNA和蛋白水平的表達情況,了解內(nèi)源性PTX3影響角膜上皮抗真菌固有免疫的機制。結(jié)果:(1)正常人、大鼠角膜上皮和體外培養(yǎng)的角膜上皮細胞可以表達PTX3。輕、中、重組真菌性角膜炎患者角膜上皮中PTX3 mRNA的表達較正常組均顯著升高;角膜炎癥程度越重,PTX3的表達量越高(p0.001)。煙曲霉菌感染大鼠模型中,角膜上皮PTX3 mRNA和蛋白的表達均在16h達高峰。PTX3在真菌感染組的表達明顯高于正常對照組和損傷對照組(p0.05,p0.001)。在體外培養(yǎng)的角膜上皮細胞中,煙曲霉菌孢子刺激可以上調(diào)PTX3的表達,其mRNA和蛋白分別在4h和8h達高峰(p0.001)。(2)利用piceatannol、U0126-EtOH、SP600125分別抑制Syk、MEK、JNK可以下調(diào)煙曲霉菌誘導(dǎo)的PTX3的產(chǎn)生(p0.001),而laminarin、SB203580分別抑制Dectin-1、p38 MAPK后對煙曲霉菌誘導(dǎo)的PTX3產(chǎn)生無明顯影響(p0.05)。(3)siRNA阻斷內(nèi)源性PTX3可以下調(diào)角膜上皮細胞在煙曲霉菌刺激時IL-1β的表達(p0.001)、降低MAPK通路中ERK1/2和JNK蛋白的磷酸化水平(p0.001),但對p38 MAPK蛋白的磷酸化水平和MAPKs總蛋白的表達水平無明顯影響(p0.05)。結(jié)論:PTX3是角膜上皮抗煙曲霉菌免疫的一個重要組成部分,可以反映炎癥的程度。Syk、MEK1/2和JNK是調(diào)控?zé)熐咕碳r角膜上皮表達PTX3的靶點。PTX3可以通過促進角膜上皮的炎癥反應(yīng)發(fā)揮抗煙曲霉菌的作用。
[Abstract]:Objective: (1) to study the expression and regularity of PTX3 in the antifungal inherent immunity of corneal epithelium. (2) whether the Dectin-1/Syk and MAPKs signaling pathways are involved in the regulation of the expression of PTX3 in the corneal epithelium. (3) to explore the role of endogenous PTX3 in the anti fungal inherent immunity of corneal epithelium and its possible mechanism. Methods: This study was divided into three parts. We studied the expression of PTX3 in the fungal keratitis model and human corneal epithelial cells cultured in vitro respectively. The expression of PTX3 after fungal infection was investigated. The expression of PTX3 mRNA was detected by fluorescence quantitative PCR, and the expression of PTX3 protein was detected by immunohistochemistry or Western Blot. (1) May 2013 The corneal epithelial tissue surrounding the cornea of the focus was collected as an infection group, and the remaining peripheral skin tissue of the cornea was made as normal control. The angle of the cornea was detected in the cornea of the eye department of the Affiliated Hospital of Qiingdao University in October 2015. The expression of PTX3 mRNA and protein in the infection of Aspergillus fumigatus before and after infection of Aspergillus fumigatus, the expression of PTX3 protein in human corneal tissue was located by immunohistochemical staining. Meanwhile, the samples were grouped according to the degree of inflammatory reaction of corneal ulcer (mild, moderate, severe), and the inflammatory response of different degrees after PTX3 and fungal infection was analyzed and compared. (2) 50 healthy Wistar rats were randomly divided into 3 groups: the blank control group, the damage control group and the fungal infection group, the corneal epithelium was scraped to detect the difference in the expression of PTX3 at the level of mRNA and protein. (3) the inactivated Aspergillus fumigatus spores antigen was used to stimulate in vitro culture in vitro. Cultured HCECs, establish an in vitro model of Aspergillus fumigatus infection, detect the expression of PTX3 at gene and protein levels after different times of stimulation of Aspergillus fumigatus. Two, select the most significant time points of PTX3 gene and protein expression (4h and 8h) under the stimulation of Aspergillus fumigatus (4h and 8h), Laminarin (Dectin-1 blocker), Piceatannol (Syk inhibitor), SB20, respectively. 3580 (p38MAPK inhibitor), U0126-Et OH (MEK inhibitor) and SP600125 (JNK inhibitor) pretreated HCECs, adding inactivated Aspergillus fumigatus spores antigen suspension to explore whether Dectin-1/Syk and MAPK signaling pathways were involved in the expression and regulation of PTX3. Three, PTX3 was induced in the inherent immune process of Aspergillus fumigatus in the upper cornea. In human corneal epithelial cells cultured in vitro, PTX3 siRNA pretreated HCECs to block endogenous PTX3 production, and then co culture with Aspergillus fumigatus spores. Western Blot was used to detect the changes in the total amount of MAPKs protein and phosphorylation level of the inflammatory signaling pathway molecules, and the fluorescence determination PCR and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) were detected respectively. The expression of terminal inflammatory factor IL-1 beta at the level of mRNA and protein to understand the mechanism of endogenous PTX3 affecting the antifungal inherent immunity of corneal epithelium. Results: (1) normal people, corneal epithelium and cultured corneal epithelial cells in vitro can express PTX3. light, and the expression of PTX3 mRNA in the corneal epithelium of the patients with recombinant fungal keratitis is more positive. The higher the degree of keratitis, the higher the degree of keratitis, the higher the expression of PTX3 (p0.001). In the rat model of Aspergillus fumigatus infection, the expression of PTX3 mRNA and protein in the corneal epithelium at the peak of 16h was higher than that of the normal control group and the damage control group (P0.05, p0.001). The corneal epithelial cells cultured in vitro were in vitro. The spore stimulation of Aspergillus fumigatus can increase the expression of PTX3, and its mRNA and protein at 4H and 8h peak (p0.001). (2) using piceatannol, U0126-EtOH, SP600125 to inhibit Syk, MEK, JNK can reduce the production of Aspergillus fumigatus induced by Aspergillus fumigatus. There was no significant effect of PTX3 (P0.05). (3) siRNA blocking endogenous PTX3 can down regulate the expression of IL-1 beta in corneal epithelial cells (p0.001) and decrease the phosphorylation level of ERK1/2 and JNK protein in MAPK pathway (p0.001), but there is no significant effect on the phosphorylation level of p38 MAPK protein and the expression level of total protein. PTX3 is an important part of the immunity of corneal epithelia against Aspergillus fumigatus. It can reflect the degree of inflammation of.Syk. MEK1/2 and JNK are the target.PTX3 that regulate the expression of PTX3 in corneal epithelium stimulated by Aspergillus fumigatus. The effect of anti Aspergillus fumigatus can be played by promoting the inflammatory reaction of corneal epithelium.
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R772.2

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本文編號：2127778