本文選題：角膜移植免疫排斥 + 虹膜��； 參考：《青島大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：目的:研究角膜移植免疫排斥反應(yīng)中虹膜的病理及功能改變,在此基礎(chǔ)上探討前房植入環(huán)孢素A緩釋片(Cyclosporine A drug delivery system,Cs A DDS)防治角膜移植免疫排斥反應(yīng)的可能機制。方法:(1)角膜移植免疫排斥時虹膜的病理改變建立以BALB/C小鼠為角膜供體及受體的同系移植組,以C57BL/6J小鼠為角膜供體、BALB/C小鼠為角膜受體的異系移植組,在此基礎(chǔ)上著重對虹膜的病理變化進行分析。于術(shù)后2周異系移植組小鼠發(fā)生角膜移植免疫排斥反應(yīng)時進行以下實驗:(1)血管通透性變化檢測:分別采用異硫氰酸熒光素葡聚糖(FITC-Dextran)及伊文思藍(Evans Blue)為染料行血管造影觀察各組小鼠虹膜血管通透性的變化,并通過房水涂片瑞氏-吉姆薩染色觀察房水中免疫細胞的浸潤情況;(2)細胞因子檢測:通過實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)比較各組小鼠虹膜內(nèi)主要細胞因子白細胞介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)、IL-6、IL-12等表達水平的差異;(3)免疫細胞分析:應(yīng)用免疫熒光染色觀察各組小鼠虹膜內(nèi)CD4+T淋巴細胞的浸潤情況;(4)NF-κB活性分析:利用免疫熒光技術(shù)檢測虹膜內(nèi)NF-κB活性的變化(主要檢測p65、磷酸化p65的表達和細胞內(nèi)定位)。(2)免疫微環(huán)境改變對虹膜色素上皮細胞功能的影響及其可能機制利用小鼠虹膜色素上皮細胞(Iris pigment epithelial cells,IPEs)與脾淋巴細胞共培養(yǎng)模型,研究IFN-γ模擬的炎性免疫微環(huán)境對IPE細胞功能的影響。將IPE細胞分為正常對照組、IFN-γ組、IFN-γ+Cs A組、IFN-γ+NF-κB抑制劑(JSH23)組,分別刺激48小時,收集各組IPE細胞與羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(5,6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester,CFSE)標(biāo)記的脾淋巴細胞共培養(yǎng)96h,進行以下分析:(1)通過流式細胞技術(shù)檢測各組IPE細胞對CD4+T細胞增殖的抑制率;(2)采用ELISA檢測各組共培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-2的含量;(3)應(yīng)用Western blot技術(shù)分析IPE細胞中NF-κB活性的變化。(3)前房植入Cs A DDS對虹膜的影響及其抑制角膜移植免疫排斥反應(yīng)的可能機制利用縫線法誘導(dǎo)兔角膜新生血管并在新生血管化的植床上行穿透性角膜移植,將實驗動物隨機分為對照組及Cs A DDS組,其中對照組術(shù)后未予藥物干預(yù),Cs ADDS組在行角膜移植術(shù)時前房植入Cs A DDS。術(shù)后觀察角膜植片的變化情況并著重分析虹膜的病理改變,行如下實驗:(1)臨床觀察:利用裂隙燈顯微鏡評估角膜植片的排斥情況并繪制角膜生存曲線,通過激光共聚焦顯微鏡(in vivo laser scanning confocal microscopy)和眼前節(jié)光學(xué)相干斷層成像(anterior segment optical coherence tomography,AS-OCT)等檢查評估前房植入Cs A DDS防治角膜移植免疫排斥反應(yīng)的效果;(2)虹膜及房水病理改變:借助虹膜蘇木素-伊紅染色、房水涂片瑞氏-吉姆薩染色觀察前房植入Cs A DDS對虹膜及房水的影響;(3)虹膜中細胞因子檢測:應(yīng)用q RT-PCR比較各組虹膜中細胞因子和共刺激分子的表達水平差異;(4)房水中細胞因子測定:采用ELISA技術(shù)檢測房水中IL-2的含量;(5)虹膜中免疫細胞分析:利用免疫熒光技術(shù)比較各組虹膜中CD4+T淋巴細胞的浸潤情況;(6)虹膜內(nèi)NF-κB活性分析:通過免疫熒光技術(shù)比較各組虹膜中NF-κB的活性變化(主要檢測p65的表達和細胞內(nèi)定位)。結(jié)果:(1)角膜移植免疫排斥時虹膜內(nèi)的炎癥反應(yīng)增強與同系移植組相比,異系移植組小鼠虹膜內(nèi)血管管腔明顯擴大,血管的滲漏性顯著增強;虹膜和角膜中IL-1β、IL-6、IL-12、IL-15的m RNA表達水平顯著上調(diào)、并出現(xiàn)大量CD4+T淋巴細胞的浸潤;虹膜和角膜中p65及磷酸化p65的表達水平均明顯增強,且主要定位于細胞核,提示角膜移植免疫排斥過程中虹膜及角膜中的NF-κB處于活化狀態(tài)。(2)NF-κB活性增強導(dǎo)致IPE細胞免疫抑制功能下降在IFN-γ模擬的炎性免疫微環(huán)境下,IPE細胞抑制CD4+T細胞增殖的能力明顯降低,其共培養(yǎng)上清中IL-2及IFN-γ的含量顯著增加;而Cs A可顯著增強IPE細胞對CD4+T細胞增殖的抑制作用(P0.01),并有效減少共培養(yǎng)上清中IL-2及IFN-γ的含量(P0.01)。此外,在IFN-γ刺激下IPE細胞的NF-κB活性顯著增強(主要表現(xiàn)為p65的磷酸化水平明顯增加),而Cs A則可明顯抑制IPE細胞的NF-κB活性(主要表現(xiàn)為p65磷酸化水平顯著下降);同時利用小分子化合物JSH23抑制NF-κB也能增強IPE細胞的免疫抑制功能,提示Cs A可通過抑制NF-κB的活性改善IPE細胞的免疫抑制功能。(3)前房植入Cs A DDS可有效減輕虹膜內(nèi)的炎癥反應(yīng)與對照組相比,前房植入Cs A DDS除可以顯著抑制角膜內(nèi)的免疫反應(yīng)外,還可以顯著改善虹膜及房水的病理變化:前房植入Cs A DDS可明顯抑制虹膜內(nèi)的血管擴張并減少房水中免疫細胞的浸潤,降低虹膜中IFN-γ、IL-2、IL-6及共刺激分子CD80、CD86的表達水平,抑制房水內(nèi)IL-2的表達水平(P0.01),減少虹膜內(nèi)CD4+T淋巴細胞的浸潤。此外,Cs A DDS組虹膜中p65的表達水平及其細胞核定位也較對照組明顯減少,提示Cs A DDS對上述病理變化的改善作用可能與NF-κB活性降低有關(guān)。結(jié)論:(1)角膜移植免疫排斥過程中,虹膜內(nèi)炎癥反應(yīng)增強,NF-κB異常活化。(2)在IFN-γ模擬的炎性免疫微環(huán)境下,IPE細胞NF-κB的活性增強導(dǎo)致其免疫抑制功能下降,而Cs A可通過抑制NF-κB的活性顯著改善IPE細胞的免疫抑制功能。(3)前房植入Cs A DDS除抑制角膜內(nèi)的免疫反應(yīng)外,還可通過抑制虹膜內(nèi)的炎癥反應(yīng)有效防治角膜移植免疫排斥。
[Abstract]:Objective : To study the pathological and functional changes of iris in mice with corneal transplantation , and to investigate the possible mechanism of transplantation immune rejection in mice . Methods : ( 1 ) The changes of the expression of IL - 1尾 , IL - 1尾 , IL - 6 , IL - 12 in the iris were observed by means of real - time PCR and quantitative real - time PCR . ( 2 ) The effect of immune microenvironment on the function of iris pigment epithelial cells and its possible mechanism were used to study the effect of inflammatory immune microenvironment on IPE cell function by using mouse iris pigment epithelial cells ( IPEs ) . Objective : To investigate the effect of anterior chamber implantation of Cs A DDS on iris and corneal allograft rejection . ( 2 ) To investigate the effect of corneal transplantation on iris and aqueous humor in anterior chamber . In addition , the activity of NF - 魏B in the anterior chamber significantly inhibited the expression level of IL - 2 and IFN - 緯 in the iris , and the expression level of IL - 2 and IFN - 緯 in the iris was significantly decreased . ( 3 ) In addition to inhibiting the immune response in the cornea , the anterior chamber can effectively prevent corneal transplantation immune rejection by inhibiting the inflammatory response in the iris .
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R779.65

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本文編號：2042144