本文選題：耳聾 + 誘導(dǎo)多能干細胞��； 參考：《浙江大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：耳聾是臨床常見疾病,在耳聾人群中,由內(nèi)耳毛細胞、聽神經(jīng)及各級聽中樞不可逆損傷導(dǎo)致的感音神經(jīng)性聾占重度耳聾的絕大部分。長期以來,對于感音神經(jīng)性耳聾的治療手段有助聽器和人工耳蝸植入等,但這些方法并不能從根本上解決問題。人內(nèi)耳耳蝸中只有約15000個毛細胞,外界聲音的過度刺激、化療、氨基糖苷類藥物的副作用及年齡的增長都能夠?qū)е掠泄δ艿拿毎麛?shù)量減少。在人體內(nèi),毛細胞的不能再生直接導(dǎo)致聽力衰退與耳聾。而毛細胞位于封閉的內(nèi)耳環(huán)境中,加之其數(shù)量有限,這成為我們研究其損傷及再生機制的障礙。誘導(dǎo)多能干細胞(iPSCs)技術(shù)的興起為臨床研究和治療耳聾提供了無限可能。這種技術(shù)能夠?qū)Χ喾N體細胞進行重編程,并將其誘導(dǎo)為與胚胎干細胞具有相同全能性的多能性細胞,只要給予一定的分化條件,這種細胞就能在體外誘導(dǎo)分化為幾乎所有類型的細胞。這種技術(shù)直接規(guī)避了利用人胚胎干細胞進行研究的倫理問題；自體iPS細胞的產(chǎn)生也排除了免疫排斥的問題,使個體化醫(yī)療成為可能；構(gòu)建的疾病來源的iPSC成為疾病研究及藥物篩選的良好模型。目前已有多種疾病來源的人體細胞被重編程為iPS細胞,但耳聾來源的iPS細胞的建立未見報道。因此,本研究中采用誘導(dǎo)多能干細胞技術(shù),完成了建立MYO7A突變的耳聾病人特異性iPS細胞株、向內(nèi)耳毛細胞分化及基因矯正的研究。第一部分：首先,我們從正常人、MYO7A基因雜合雙突變耳聾患者及其聽力表現(xiàn)為正常但MYO7A基因單突變的父親尿液中提取了尿液細胞,并將其誘導(dǎo)為iPS細胞；其次,我們對構(gòu)建的三株iPS細胞全能性進行了檢測分析。細胞形態(tài)、堿性磷酸酶染色、全能性基因表達、全能性標志蛋白免疫熒光、擬胚體形成及分化實驗、畸胎瘤形成實驗都表明,我們構(gòu)建的三株iPS細胞均具有全能性。核型分析表明,我們構(gòu)建的iPS細胞染色體結(jié)構(gòu)正常,并未在誘導(dǎo)過程中受到破壞。最終結(jié)果表明,MYO7A突變的耳聾患者來源的尿液細胞與正常細胞一樣,都能被重編程為具有全能性的誘導(dǎo)多能干細胞。第二部分：由于MYO7A在內(nèi)耳耳蝸中只在毛細胞中表達,為了研究這一基因的突變對毛細胞功能有何影響及具體致聾機制,我們將正常人、MY07A突變耳聾患者及其父親的特異iPS細胞向內(nèi)耳祖細胞及進一步向內(nèi)耳毛細胞誘導(dǎo)分化。在誘導(dǎo)過程中,我們采用細胞單層貼壁法,分兩個階段進行。向內(nèi)耳祖細胞誘導(dǎo)階段：通過添加FGF3和FGF10,使三株iPS細胞單層貼壁,誘導(dǎo)12天后,iPS細胞誘導(dǎo)分化為內(nèi)耳神經(jīng)樣祖細胞和內(nèi)耳上皮樣祖細胞。早期內(nèi)耳標志性基因表達檢測和蛋白免疫熒光檢測表明,三株iPS細胞成功分化為內(nèi)耳祖細胞,并且各分化指標在三株細胞間沒有顯著性差異。這表明,無論是正常的還是MYO7A突變的iPS細胞,都能被誘導(dǎo)分化為內(nèi)耳祖細胞,三株細胞的分化表現(xiàn)趨向一致。向毛細胞誘導(dǎo)階段：我們將內(nèi)耳上皮樣祖細胞分離出來,添加EGF和維甲酸,貼壁誘導(dǎo)3周后,對分化的細胞進行毛細胞標志性基因表達檢測及毛細胞標志性蛋白免疫熒光檢測,結(jié)果表明正常人、MYO7A突變耳聾患者及其父親來源的iPS細胞都能被誘導(dǎo)為毛細胞樣細胞,且三株分化的毛細胞樣細胞都表現(xiàn)了毛細胞特有的電生理功能。但是,具有MYO7A雜合雙突變的分化的毛細胞對于FM1-43具有極低的內(nèi)吞效率,電生理檢測中IK1和ICa與正常iPS細胞來源的毛細胞樣細胞相比顯著偏大,且其靜纖毛在聚攏成束中的表現(xiàn)與正常來源的毛細胞有明顯區(qū)別；利用western blot對myosin7a蛋白表達檢測表明,MY07A突變導(dǎo)致了一個縮短了的myosin7a蛋白的產(chǎn)生。以上結(jié)果表明,MY07A的突變是通過影響靜纖毛束的功能來使毛細胞功能失常。第三部分：為了研究利用體外細胞株進行基因矯正、以作為臨床應(yīng)用的可行性,我們利用CRISPR-Cas9介導(dǎo)的同源重組技術(shù),對MYO7A雜合雙突變來源的iPS細胞的其中一個突變位點進行基因矯正。在經(jīng)過初步流式分選之后,測序分析和酶切驗證分析表明,有7.5%士1.3%的細胞被純合矯正。之后我們對十個潛在脫靶位點進行PCR測序分析,未見有脫靶現(xiàn)象。全能性檢測結(jié)果表明,矯正后的iPS細胞株仍具有iPS特異的全能性。這表明我們將雜合雙突變中的其中一個突變位點矯正成功。將這一矯正后的細胞株向內(nèi)耳毛細胞分化后,其在基因表達、蛋白表達等分化指標的表現(xiàn)與正常來源的iPS細胞分化的毛細胞樣細胞表現(xiàn)一致,說明經(jīng)過基因矯正操作后的iPS細胞仍能分化為內(nèi)耳毛細胞。對這一iPS細胞株分化的毛細胞樣細胞進行掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn),靜纖毛重新聚攏成束；Western blot檢測表明,myosin7a蛋白條帶與正常來源的毛細胞相同；分化的毛細胞中能夠內(nèi)吞FM1-43FX的比例恢復(fù)正常水平；電生理檢測中,IK1和ICa恢復(fù)正常值。以上研究結(jié)果表明,我們成功將iPS細胞中MYO7A的一個突變位點進行了基因矯正,并且其分化為毛細胞的功能得到了修復(fù)。總之,本研究證明了耳聾來源的尿液細胞能夠構(gòu)建為iPS細胞,同時證明iPS細胞能向內(nèi)耳毛細胞誘導(dǎo)分化。經(jīng)過基因矯正的耳聾來源的iPS細胞在向毛細胞分化后,相關(guān)功能恢復(fù)正常,這為臨床治療耳聾提供了一個新的思路和途徑。
[Abstract]:Deafness is a common clinical disease. In the deaf people, the sensorineural deafness caused by the inner ear hair cells, the auditory nerve and the irreversible damage of the auditory center at all levels accounts for most of the severe deafness. For a long time, the treatment methods for sensorineural deafness are hearing aids and artificial cochlear implants, but these methods can not be fundamentally solved. Problems. There are only about 15000 hair cells in the inner ear cochlea, overstimulation of external sound, chemotherapy, side effects of aminoglycosides and age, which can lead to a decrease in the number of functional hair cells. In the human body, the inability of hair cells to regenerate directly leads to hearing loss and deafness. In addition to its limited number, this has become an obstacle to our research on the mechanism of damage and regeneration. The rise of the induction of pluripotent stem cells (iPSCs) technology provides an infinite possibility for clinical research and treatment of deafness. This technique can reprogram a variety of somatic cells and induce it to be the same versatility with embryonic stem cells. As long as the cells are given certain differentiation conditions, the cells can be induced to differentiate into almost all types of cells in vitro. This technique directly avoids the ethical problems of using human embryonic stem cells for research; the production of autologous iPS cells also excludes the questions of immune rejection, making individualized medical treatment possible; the disease constructed. IPSC, a source of disease, has become a good model for disease research and drug screening. At present, the human cells of a variety of diseases have been reprogrammed into iPS cells, but the establishment of iPS cells from the source of deafness has not been reported. Therefore, in this study, the induction of pluripotent stem cell technology has been used to complete the specific iPS cell line of the deafness patients with the construction of MYO7A mutation. Study on the differentiation and gene correction of the inner ear hair cells. First part: first, we extracted the urine cells from the normal human, MYO7A gene heterozygous double mutant deafness and its hearing expression normal but single mutation of the MYO7A gene, and induced it to iPS cells; secondly, we have the total energy of the three iPS cells constructed. Cell morphology, alkaline phosphatase staining, omnipotent gene expression, omnipotent marker protein immunofluorescence, embryogenic body formation and differentiation experiments, and teratoma formation experiments showed that all of the three iPS cells constructed by us were omnipotent. Karyotype analysis showed that the chromosome structure of our iPS cells was normal and did not exist. The final result shows that the urine cells derived from the MYO7A mutant of the deafness can be reprogrammed into the omnipotent induced pluripotent stem cells, like normal cells. The second part: because MYO7A is only expressed in the hair cells in the inner ear cochlea, it is the study of the mutation of this gene to the function of hair cells. In the induction process, we use cell monolayer adherence to induce the differentiation of MY07A mutant deafness and their father's specific iPS cells to inner ear hair cells and further to the inner ear hair cells. In the induction process, we use the cell monolayer method in two stages. The induction stage to the inner ear progenitor cells: by adding FGF3 and FGF10 After 12 days, three iPS cells were induced to differentiate into inner ear nerve like progenitor cells and inner ear epithelioid progenitor cells. The early inner ear marker gene expression detection and protein immunofluorescence test showed that three iPS cells successfully differentiated into the inner ear progenitor cells, and the differentiation indexes were not significant difference between the three cells. This shows that both normal and MYO7A mutant iPS cells can be induced to differentiate into inner ear progenitor cells, and the differentiation of three cells tends to be consistent. Gene expression detection and hair cell marker protein immunofluorescence detection showed that normal people, MYO7A mutant deafness and their father's iPS cells could be induced to hair cell like cells, and the three differentiated hair cell like cells displayed the characteristic electrophysiological function of the hair cells. However, the MYO7A heterozygous double mutation was found. The hairy cells have very low endocytosis for FM1-43. In electrophysiological tests, IK1 and ICa are significantly larger than those of normal iPS cells, and the expression of its static cilia in the bundles is distincently different from that of normal hair cells. The detection of the expression of myosin7a protein by Western blot shows that MY07A mutation A shortened myosin7a protein was produced. The above results show that the mutation of MY07A is caused by the function of the cilium bundle to make the hair cell dysfunction. Third part: in order to study the use of an in vitro cell line for gene correction in order to be used as a clinical application, we use CRISPR-Cas9 mediated homologous recombination technology. Gene correction of one of the mutation sites of the MYO7A heterozygous double mutation source of iPS cells. After preliminary flow sorting, sequencing and enzymatic analysis showed that 7.5% of 1.3% of the cells were corrected by homozygosity. After that, we carried out PCR sequencing analysis of ten potential target loci and did not have a missing target. Omnipotent detection The results showed that the corrected iPS cell line still had iPS specific omnipotent. This showed that we corrected one of the mutation sites in the heterozygous double mutation. After the differentiation of the corrected cell line to the inner ear hair cells, the differentiation index of the gene expression and protein expression and the capillary differentiation of the normal iPS cells were observed. The cell like cells showed the same expression, indicating that the iPS cells after the gene correction could still differentiate into inner ear hair cells. The scanning electron microscopy of the hair cell like cells differentiated from the iPS cell line found that the static cilia was reassembled into bundles, and the Western blot detection showed that the myosin7a band was the same as the normal hair cells; In the hair cells, the ratio of endocytosis to FM1-43FX was restored to normal level; in electrophysiological tests, IK1 and ICa were restored to normal values. The above results showed that we successfully corrected a mutation of MYO7A in iPS cells and the function of its differentiation into hair cells was repaired. In conclusion, this study proved the source of deafness. The urine cells can be constructed as iPS cells and prove that the iPS cells can induce differentiation into the inner ear hair cells. The related functions of iPS cells, which are derived from the genetically modified deafness cells, are restored to normal after the differentiation of the hair cells. This provides a new way of thinking and path for the clinical treatment of deafness.
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R764.43

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本文編號：2005693