本文選題：年齡相關(guān)性白內(nèi)障 + 磷酸化��； 參考：《復(fù)旦大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：白內(nèi)障是全球首位致盲眼病,而年齡相關(guān)性白內(nèi)障(age related cataract,ARC)也是老年人視力下降的主要原因。目前手術(shù)仍是治療白內(nèi)障唯一有效的方法,由于我國人口數(shù)量龐大,經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá),高昂的手術(shù)費用會給社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此,預(yù)防或者推遲ARC發(fā)病,無疑具有重要意義。 磷酸化是一種常見蛋白質(zhì)翻譯后修飾,磷酸化與去磷酸化這一可逆的過程調(diào)節(jié)著信號傳導(dǎo)、基因表達(dá)等多種細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程,而蛋白質(zhì)磷酸化修飾的異常會引發(fā)一系列疾病。晶狀體蛋白是人晶狀體內(nèi)含量最高的結(jié)構(gòu)與功能蛋白,研究者推測晶狀體蛋白的磷酸化與去磷酸化的過程失調(diào)可能是ARC發(fā)病的早期改變或者說是晶狀體蛋白變性前的病變。 由于晶狀體蛋白磷酸化過程是可逆的,因此在晶狀體蛋白尚未發(fā)生變性的早期,也即白內(nèi)障形成之前是干預(yù)ARC發(fā)病的有效時機。鑒定晶狀體蛋白的磷酸化位點,將是進(jìn)一步探索位點功能的第一步。 本實驗首次利用原位酶解聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜鑒定人透明品狀體與ARC晶狀體組織切片中的磷酸化位點。研究者在人透明晶狀體中鑒定到了4種晶狀體蛋白中的8個磷酸化位點；在ARC晶狀體中鑒定到了6種晶狀體蛋白中的11個磷酸化位點,其中9個磷酸化位點先前未有報道。 本實驗為進(jìn)一步的磷酸化位點質(zhì)譜成像定位和磷酸化位點的功能學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。 目的：探求人晶狀體組織冰凍切片的最佳條件并優(yōu)化基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜對晶狀體組織切片鑒定的實驗參數(shù)。 方法：(1)將-80℃凍存的人透明晶狀體與ARC晶狀體分別在-10℃至-25℃溫度下沿赤道部軸向切片,切片厚度10μm至20μm,用解剖鏡觀察所得切片,確定最適宜的溫度與切片厚度。 (2)使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白細(xì)胞色素C與馬心肌紅蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,從基質(zhì)種類、基質(zhì)噴涂層數(shù)、噴涂速度等各方面優(yōu)化并探尋最佳的基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜鑒定晶狀體組織切片中磷酸化位點的實驗參數(shù)。 結(jié)果：經(jīng)過解剖鏡觀察,最適宜的切片溫度為-18℃,切片厚度為141μm。此條件下切片完整性好,易于轉(zhuǎn)移和進(jìn)一步的質(zhì)譜鑒定�；|(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜鑒定人晶狀體組織切片的最佳實驗條件為：以加入0.1%三氟乙酸、0.6-0.8mg/ml檸檬酸氨的濃度為2.5mg/mL的α-氰基-4-羥基-肉桂酸(50%乙腈：50%水)為基質(zhì),直接噴涂在組織切片表面；加熱溫度120℃,基質(zhì)流速O.100ml/min,噴頭移動速度200mm/min,晾干后進(jìn)行質(zhì)譜檢測。所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用DataExPlorer4.5進(jìn)行后期處理。 結(jié)論：確立了人晶狀體組織冰凍切片的最佳條件,并優(yōu)化了基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜對人晶狀體組織切片鑒定的實驗條件與實驗參數(shù),為進(jìn)一步的研究奠定了基礎(chǔ)。 目的：在優(yōu)化了的實驗條件下,利用原位酶解聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜鑒定年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體及人透明晶狀體中晶狀體蛋白的磷酸化位點并比較其差異。 方法：(1)將-80℃凍存的人透明晶狀體與年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體在-18℃溫度下沿赤道部軸向切片,切片厚度14μm,隨后將組織切片轉(zhuǎn)移至蓋玻片上。 (2)用肌紅蛋白、牛血清白蛋和α-酪蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白對胰蛋白酶-石墨烯固定化酶反應(yīng)器的酶解效率進(jìn)行考察。 (3)利用胰蛋白酶-石墨烯固定化酶反應(yīng)器聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜鑒定人透明晶狀體與年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體組織切片中的磷酸化位點,所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用DataExPlorer4.5進(jìn)行后期處理。 結(jié)果：研究者在人透明晶狀體中鑒定到了4種晶狀體蛋白中的8個磷酸化位點；在年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體中鑒定到了6種晶狀體蛋白中的11個磷酸化位點,其中9個磷酸化位點先前未有報道。 結(jié)論：首次利用原位酶解聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜在年齡相關(guān)性白內(nèi)障品狀體中鑒定到了6種晶狀體蛋白中的11個磷酸化位點,為進(jìn)一步的質(zhì)譜成像定位和磷酸化位點的功能性研究奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Cataract is the leading cause of blindness in the world, and age related cataract (ARC) is also the main reason for the decline of visual acuity in the elderly. Surgery is still the only effective method for the treatment of cataract. Because of the huge population, less developed economy and high cost of operation, it will bring a heavy economic burden to the society. It is of great importance to prevent or delay the onset of ARC.
Phosphorylation is a common post-translational modification of protein. The reversible process of phosphorylation and dephosphorylation regulates a variety of cellular biological processes, such as signal transduction, gene expression, and so on, and the abnormal phosphorylation of proteins leads to a series of diseases. The crystalline protein is the highest content structure and functional protein in the human crystalline body. It is speculated that the imbalance of phosphorylation and dephosphorylation of lens protein may be an early change in ARC pathogenesis or a pathological change before lens protein degeneration.
Since the phosphorylation of the crystallin is reversible, it is an effective time to intervene in the pathogenesis of ARC before the lens protein has not been denatured. The identification of the phosphorylation site of the lens protein will be the first step to further explore the function of the loci.
This experiment was the first time to identify phosphorylation sites in human transparent substance and ARC lens tissue slices by in situ enzyme solution combined with matrix assisted laser analytical ionization mass spectrometry. The researchers identified 8 phosphorylation sites in 4 kinds of lens proteins in the human transparent lens; 11 of the 6 kinds of lens proteins were identified in the ARC lens. A phosphorylation site, of which 9 phosphorylation sites have not been reported previously.
This study laid a foundation for further localization of phosphorylation site mass spectrometry and functional study of phosphorylation sites.
Objective: To explore the optimum conditions for frozen section of human lens and optimize the experimental parameters of the identification of lens tissue by matrix assisted laser analytical ionization mass spectrometry.
Methods: (1) the transparent lens and ARC lens, frozen at -80 C, were sliced along the equator at the temperature of -10 and -25, respectively. The thickness of the slice was 10 m to 20 u m, and the sections were observed with the anatomical mirror to determine the optimum temperature and thickness of the slice.
(2) using the standard protein cytochrome C and the horse heart myoglobin as the standard protein, the test parameters for the identification of phosphorylation sites in the lens tissue sections are optimized from the types of matrix, the number of stroma spraying layers, and the speed of spraying.
Results: the most suitable slice temperature was -18 C, and the thickness of the slice was 141 u m.. The section integrity was good, the transfer and mass spectrometric identification were easy under this condition. The best experimental condition for the identification of human lens tissue section by matrix assisted laser analytical ionization mass spectrometry was to add 0.1% three FLUOROACETIC acid and 0.6-0.8mg/ml citric acid. The concentration of ammonia is 2.5mg/mL cyanohydroxyl -4- hydroxyl cinnamic acid (50% acetonitrile: 50% water) as matrix and directly sprayed on the surface of tissue section; the heating temperature is 120 C, the velocity of matrix is O.100ml/min, the velocity of the nozzle is 200mm/min, and the mass spectrometry after drying is carried out. The mass mass data is treated by DataExPlorer4.5 for late treatment.
Conclusion: the optimum conditions for freezing section of human lens tissue were established, and the experimental conditions and experimental parameters for the identification of human lens tissue section by matrix assisted laser analytical ionization mass spectrometry were optimized, which laid a foundation for further research.
Objective: to identify the phosphorylation sites of the age-related cataract lens and the human transparent lens MICROTEK body protein by in situ enzyme solution combined with matrix assisted laser analytical ionization mass spectrometry and compare the difference between them.
Methods: (1) the transparent lens stored at -80 C and the age-related cataract lens were sliced along the equator at the temperature of -18 C at the temperature of -18 C, and the thickness of the slice was 14 m, then the tissue sections were transferred to the cover glass.
(2) using myoglobin, bovine blood albumin and alpha casein as the standard protein, the enzymatic efficiency of trypsin graphene immobilized enzyme reactor was investigated.
(3) using the trypsin graphene immobilized enzyme reactor and the matrix assisted laser analytical ionization mass spectrometry to identify the phosphorylation sites in the transparent lens and the age-related cataract lens tissue sections. The mass spectrum data were processed by DataExPlorer4.5 for later treatment.
Results: the researchers identified 8 phosphorylation sites in the 4 kinds of lens proteins in the human transparent lens; 11 phosphorylation sites of 6 kinds of lens proteins were identified in the age-related cataract lens, of which 9 phosphorylation sites were not previously reported.
Conclusion: for the first time, 11 phosphorylation sites in 6 kinds of lens proteins were identified by in situ enzymolysis combined with matrix assisted laser analytical ionization mass spectrometry in age related cataract bodies, which laid the foundation for further functional study of mass spectrometry location and phosphorylation sites.
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R776.1

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本文編號：1951165