發(fā)布時間：2018-05-14 19:00

  本文選題：鼻咽癌 + 梭形癌細胞　； 參考：《南方醫(yī)科大學》2012年博士論文

【摘要】：背景與目的 鼻咽癌(NPC)是一種具有鮮明的地域和種族性分布的頭頸部腫瘤,具有獨特的生物學特性：大多數(shù)為未分化型非角化性癌,早期轉移至頸部淋巴結。更重要的是,患者放化療后容易出現(xiàn)復發(fā)和遠處轉移,這往往是導致患者死亡的主要原因。80年代初期,姚開泰就首次提出鼻咽癌發(fā)病的“三次打擊”假說,即EB病毒(EBV)、化學致癌物和胚性擊中(即遺傳因素或自發(fā)/誘發(fā)突變)構成NPC的主要病因。近年來,學者們對鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的分子機制亦作了大量的研究。然而,鼻咽癌惡性侵襲和轉移的分子機制十分復雜。如何能早期對鼻咽癌患者的侵襲和轉移潛能進行準確評估,從而指導臨床進行及時、有效的治療,提高鼻咽癌患者的生存率、改善其預后,這是廣大醫(yī)療和科研工作者當務之急。 癌干細胞(CSCs)目前是腫瘤研究中的熱點之一。CSCs理論認為腫瘤組織內(nèi)有一小群細胞具有與干細胞類似的特性,即具有自我更新和多向分化的生物學特性,是惡性腫瘤患者出現(xiàn)局部復發(fā)和遠處轉移以及放化療耐受的根源所在。近年來,學者們已通過表面分子標志物篩選成功分離和鑒定乳腺癌、結腸癌和肺癌等多種實體惡性腫瘤。2007年,姚開泰等最先提出和證實了鼻咽癌組織中存在CSCs細胞。最近,我們首次證實ALDH1(乙醛脫氫酶1)可作為分離和鑒定鼻咽癌CSCs的一種可靠的分子標記物。有興趣的是,愈來愈多的研究表明,CSCs'‘干性”與EMT(上皮細胞-間充質細胞轉化)的發(fā)生有著密切的聯(lián)系。廣為人知,EMT在惡性腫瘤的擴散和轉移中起著重要的作用,其促使腫瘤細胞更容易從原發(fā)灶脫離,從而往周邊間質進行侵襲和擴散。在鼻咽癌組織病檢切片中,我們觀察到,侵襲邊緣或者浸潤周邊組織中的腫瘤細胞常常呈梭形間充質細胞形態(tài)。我們前期研究發(fā)現(xiàn),這些梭形細胞中ALDH1的表達水平明顯上調(diào),提示其具有CSCs'‘干性”特性。早在1960年,我國著名的病理學家梁伯強就發(fā)現(xiàn),這些具有高度侵襲能力的梭形細胞容易侵犯患者的顱底神經(jīng)。然而,有關這種梭形癌細胞的惡性生物學行為以及相關分子特征,至今為止,人們知之甚少。 因此,本課題的主要研究目的是：①檢測這些梭形癌細胞與EMT發(fā)生之間的關系；②檢測EMT相關蛋白在鼻咽癌組織中的表達情況,分析其表達與鼻咽癌的侵襲性生物學行為的關系,評估其對患者預后的影響；③進一步,我們擬通過表達譜芯片實驗篩選出鼻咽癌組織中EMT相關基因,為深入了解鼻咽癌侵襲和轉移惡性進程中的具體分子機制及其生物學功能奠定堅實的實驗基礎。 方法 1.通過免疫組化方法在115例鼻咽癌組織梭形癌細胞和47例鱗狀癌細胞中檢測Pan-cytokeratin(全角蛋白)、E-cadherin(E-鈣粘素)、N-cadherin(巢蛋白)、β-catenin、vimentin(波形蛋白)、fibronectin(纖維粘連蛋白)、Snail、Slug、ALDH1、SOX2、OCT4和Nanog等蛋白的表達情況；在此基礎上,我們擬進一步檢測梭形癌細胞的比例與鼻咽癌惡性生物學行為及預后的關系。 2.通過免疫組化和組織熒光方法檢測腫瘤出芽和ALDH1在105例鼻咽癌組織中的表達情況。 1.構建包含122例鼻咽癌組織和29例慢性鼻咽炎組織在內(nèi)的組織芯片(TMA)； 2.通過免疫組化方法檢測EMT相關蛋白E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、vimentin和Snail, CSCs相關蛋白ALDH1、SOX2、OCT4、Nanog和Nestin等蛋白在122例鼻咽癌的表達情況,分析它們的表達與臨床病理特征和患者預后之間的聯(lián)系;組織免疫熒光確證某些EMT或CSCs相關蛋白的定位表達。 3.上述EMT和CSCs相關標志物蛋白在122例鼻咽癌組織中進行聚類分析。 1.篩選出25例鼻咽癌活檢組織及8例鼻咽正常上皮組織作為芯片實驗對象,采用北京博奧22KHuman Genome Array人表達譜基因芯片進行芯片檢測； 2.SAM軟件分析差異表達基因,qRT-PCR進行鑒定。在此基礎上,通過在線網(wǎng)站進行文獻挖掘,篩選出鼻咽癌中與EMT相關基因,并對其進行GO功能分析、KEGG通路和層次聚類等分析。 結果 1.與鱗狀癌細胞比較,Pan-cytokeratin在梭形癌細胞中的表達差異無統(tǒng)計學意義(P=0.644)。相反,膜E-cadherin在梭形癌細胞中的表達明顯下調(diào),而β-catenin、N-cadherin、vimentin、fibronectin、Snail、Slug、ALDH1、SOX2、OCT4和Nanog蛋白在梭形癌細胞中的表達明顯上調(diào),兩組間的差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.001)。此外,在梭形癌細胞中,膜E-cadherin表達與漿β-catenin(P0.001)、vimentin (P0.001), fibronectin (P0.001)、Slug (P0.001)、ALDH1(P0.001)OCT4(P0.001)和Nanog(P0.001)表達呈顯著負相關,但與N-cadherin (P=0.086)、Snail (P=0.093)和SOX2(P=0.0875)之間的表達無明顯相關。 有興趣的是,我們進一步發(fā)現(xiàn),梭形癌細胞含量與鼻咽癌T分期(P=0.036)、N分期(P=0.031)、臨床分期(P=0.037)、淋巴管浸潤(P=0.025)以及生存預后(P=0.004)有密切關系。 2.在105例鼻咽癌組織中,腫瘤細胞低出芽組和高出芽組分別為53例(50.5%)和52例(49.5%)。腫瘤出芽(tumor budding)與腫瘤T分期(P=0.008)、淋巴管浸潤(P0.001)、血管浸潤(P=0.029)、頸部淋巴結轉移(P0.001)以及臨床分期(P-0.010)有著密切關聯(lián)。單因素分析表明,腫瘤出芽高組中患者總體生存率明顯低于低出芽組(P=0.002)。Cox多因素回歸分析表明,腫瘤出芽是影響患者生存預后的一個獨立因素(P=0.001)。并且,腫瘤出芽ALDH1表達與腫瘤T分期(P=0.034)、淋巴管浸潤(P=0.002)、血管浸潤(P=0.017)、頸部淋巴結轉移(P=0.035)、臨床分期(P0.001)以及總體生存期(P0.001)有著密切關聯(lián)。 1. E-cadherin胞膜和胞漿表達均與淋巴結轉移(分別P0.001和0.005)以及臨床分期(分別P0.001和0.007)有關聯(lián)。β-catenin胞漿表達與T分期(P=0.020),淋巴結轉移(P0.001)和臨床分期(P=0.036)有關,而β-catenin胞膜表達與患者的臨床病理參數(shù)均無關聯(lián)(P≥0.05)。Vimentin胞核表達與淋巴結轉移(P0.001)以及臨床分期進展(P0.001)密切相關。多因素生存分析表明,vimentin核表達(P=0.016)以及E-cadherin胞漿表達(P=0.001)是影響患者生存預后的獨立指標。胞核vimentin/胞漿E-cadherin共表達與淋巴結轉移(P0.001)以及臨床分期進展(P0.001)密切有關。更重要的是,胞核vimentin/胞漿E-cadherin共表達組中患者生存時間明顯縮短(P0.001)。 2.在122例鼻咽癌組織中,42.6%為N-cadherin胞漿高表達,45.1%為胞核高表達。N-cadherin胞漿和胞核表達與患者臨床病理參數(shù)如淋巴結轉移,遠處轉移和臨床分期(P=0.012)均顯著有關。N-cadheri胞漿和胞核之間表達水平呈正相關(P0.001)。然而,N-cadherin胞漿或胞核表達與E-cadherin之間表達無相關性(P≥0.05)。單因素分析顯示,N-cadherin胞漿表達高低對患者生存時間差異影響無統(tǒng)計學意義(P≥0.05)。然而,N-cadherin核高表達組中患者總體生存率明顯低于核表達低組(P=0.002)。此外,在鼻咽癌臨床晚期(Ⅲ-Ⅳ)患者中,N-cadherin核高表達組中的總體生存時間明顯低于表達低組(P=0.033),但對Ⅰ-Ⅱ期患者總體生存期影響無統(tǒng)計學意義。Cox模型分析表明,N-cadherin胞核表達可作為一個獨立的預后指標(P-0.024)。 3.122例鼻咽癌組織中,46例(37.7%)為Snail胞漿表達,60例(49.2%)為Snail胞核表達。除了淋巴結轉移(P=0.042),Snail胞漿表達與其它臨床病理參數(shù)之間不存在明顯關聯(lián)。相反,Snail胞核表達與T分期(P=0.045),N分期(P=0.019),M分期(P=0.046)及臨床分期進展(P=0.003)均有顯著關聯(lián)。此外Snail胞核表達與E-cadherin胞膜表達呈負相關(P=0.021)。單因素生存分析表明,鼻咽癌患者Snail胞核表達高組,而不是胞漿高表達組,其總體生存期明顯低于低表達組(P0.001)。多因素生存分析表明,Snail核表達可以獨立影響鼻咽癌患者的生存預后(P0.001),尤其是處于臨床Ⅲ-Ⅳ期患者。 4.我們的結果顯示,SOX2,OCT4和Nanog蛋白在鼻咽癌組織中表達增高,并且在腫瘤組織侵襲邊緣尤為常見,與EMT相關蛋白(E-cadherin/N-cadherin和Snail)顯著相關。Nestin在鼻咽癌組織中甚少表達,然而,其在腫瘤組織侵襲邊緣的血管內(nèi)皮細胞中表達明顯增高。侵襲邊緣SOX2,OCT4或Nanog表達高組,患者總體生存率明顯低于各低表達組(分別P=0.006,0.001和0.000)。多因素生存分析表明,OCT4和Nanog表達是影響患者預后的有價值的獨立指標(分別P=0.006和0.001)。并且,腫瘤侵襲邊緣OCT4/Nanog共表達組,患者總體生存率明顯低于其它組別(P=0.005)。此外,有興趣的是,在鼻咽癌組織的侵襲邊緣,SOX2,OCT4和Nanog與CSCs標記物ALDH1以及血管內(nèi)皮表達的Nestin蛋白呈顯著正相關(P0.001)。 5.鼻咽癌組織中侵襲邊緣ALDH1的表達與患者T分期(P=0.001), M分期(P0.001),臨床分期(P0.001)以及淋巴管浸潤(P0.001)有關,組間差異明顯有統(tǒng)計學意義。在鼻咽癌組織的侵襲邊緣,ALDH1的表達水平與EMT相關蛋白如E-cadherin胞漿表達(P=0.001),vimentin胞核表達(P0.001)以及Snail(P0.001)存在顯著正相關。單因素分析顯示,患者腫瘤侵襲邊緣ALDH1高表達組,其總體生存率明顯降低。然而,多因素生存分析表明,侵襲邊緣ALDH1表達不是影響患者預后的獨立因素。侵襲邊緣ALDH1表達對早期鼻咽癌患者(T1-T2,N0-N1)的總體生存率有著重要影響(分別P0.001,P=0.002)。 6.上述EMT和CSCs相關蛋白將122例鼻咽癌組織聚類成兩大組(Group A和Group B)。與Group A相比,Group B中膜E-cadherin表達明顯減少,而漿E-cadherin、vimentir、N-cadherin、SnaikOCT4和Nanog等表達明顯上調(diào)。而且,我們結果發(fā)現(xiàn),Group B與患者T分期、N分期、M分期、臨床分期的進展以及梭形癌細胞的比例(≥20%)有著密切聯(lián)系。更重要的是,Group B鼻咽癌患者的總體生存率明顯低于Group A組。 1.與鼻咽正常上皮組織比較,鼻咽癌組織中共有509個差異表達基因,其中表達上調(diào)基因306個,表達下調(diào)基因203個,這些差異基因主要參與細胞信號轉導,細胞粘附,蛋白酶水解,細胞周期,細胞生長和凋亡等。 2.通過專業(yè)文獻挖掘軟件,我們篩選與EMT密切相關的50個差異表達基因,GO功能分析表明,這些基因主要與轉錄調(diào)節(jié),細胞粘附,細胞信號傳導,蛋白酶水解,趨化作用及器官形成等有關。KEGG通路分析軟件表明,這些鼻咽癌EMT相關基因主要涉及到Wnt信號通路,p53信號通路和MAPK信號通路等。并且,這些差異表達基因與鼻咽癌的臨床病理特征如T分期、N分期、M分期和臨床分期密切關聯(lián)。 結論 1.鼻咽癌組織中的梭形癌細胞具有EMT和CSCs特性,其含量與鼻咽癌侵襲和轉移進程密切相關；鼻咽癌組織中侵襲邊緣存在腫瘤出芽現(xiàn)象,細胞具有CSCs特性；我們提出,前者是轉移,而后者是早期侵襲的形態(tài)學風險標志。 2.EMT相關蛋白如vimentin、N-cadherin和Snail, CSCs(?)目關蛋白如Nanog及OCT4在鼻咽癌組織中異常表達,可作為新的預測患者轉移和不良預后風險因子。 3.用22K人表達譜基因芯片在鼻咽癌組織中篩選出50個與EMT密切相關的差異表達基因,它們主要參與Wnt通路,p53通路及MAPK通路等信號傳導；這些EMT相關基因可對鼻咽癌惡性進展進行分子分型。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R739.63

【引證文獻】

相關博士學位論文 前1條

1 陳俊;14-噻吩基次亞甲基苦參堿抗鼻咽癌作用及機制的實驗研究[D];廣西醫(yī)科大學;2013年

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本文編號：1889088