本文選題：鼻咽癌 + 梭形癌細(xì)胞��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：背景與目的 鼻咽癌(NPC)是一種具有鮮明的地域和種族性分布的頭頸部腫瘤,具有獨(dú)特的生物學(xué)特性：大多數(shù)為未分化型非角化性癌,早期轉(zhuǎn)移至頸部淋巴結(jié)。更重要的是,患者放化療后容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,這往往是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。80年代初期,姚開(kāi)泰就首次提出鼻咽癌發(fā)病的“三次打擊”假說(shuō),即EB病毒(EBV)、化學(xué)致癌物和胚性擊中(即遺傳因素或自發(fā)/誘發(fā)突變)構(gòu)成NPC的主要病因。近年來(lái),學(xué)者們對(duì)鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制亦作了大量的研究。然而,鼻咽癌惡性侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制十分復(fù)雜。如何能早期對(duì)鼻咽癌患者的侵襲和轉(zhuǎn)移潛能進(jìn)行準(zhǔn)確評(píng)估,從而指導(dǎo)臨床進(jìn)行及時(shí)、有效的治療,提高鼻咽癌患者的生存率、改善其預(yù)后,這是廣大醫(yī)療和科研工作者當(dāng)務(wù)之急。 癌干細(xì)胞(CSCs)目前是腫瘤研究中的熱點(diǎn)之一。CSCs理論認(rèn)為腫瘤組織內(nèi)有一小群細(xì)胞具有與干細(xì)胞類似的特性,即具有自我更新和多向分化的生物學(xué)特性,是惡性腫瘤患者出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及放化療耐受的根源所在。近年來(lái),學(xué)者們已通過(guò)表面分子標(biāo)志物篩選成功分離和鑒定乳腺癌、結(jié)腸癌和肺癌等多種實(shí)體惡性腫瘤。2007年,姚開(kāi)泰等最先提出和證實(shí)了鼻咽癌組織中存在CSCs細(xì)胞。最近,我們首次證實(shí)ALDH1(乙醛脫氫酶1)可作為分離和鑒定鼻咽癌CSCs的一種可靠的分子標(biāo)記物。有興趣的是,愈來(lái)愈多的研究表明,CSCs'‘干性”與EMT(上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化)的發(fā)生有著密切的聯(lián)系。廣為人知,EMT在惡性腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用,其促使腫瘤細(xì)胞更容易從原發(fā)灶脫離,從而往周邊間質(zhì)進(jìn)行侵襲和擴(kuò)散。在鼻咽癌組織病檢切片中,我們觀察到,侵襲邊緣或者浸潤(rùn)周邊組織中的腫瘤細(xì)胞常常呈梭形間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)。我們前期研究發(fā)現(xiàn),這些梭形細(xì)胞中ALDH1的表達(dá)水平明顯上調(diào),提示其具有CSCs'‘干性”特性。早在1960年,我國(guó)著名的病理學(xué)家梁伯強(qiáng)就發(fā)現(xiàn),這些具有高度侵襲能力的梭形細(xì)胞容易侵犯患者的顱底神經(jīng)。然而,有關(guān)這種梭形癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為以及相關(guān)分子特征,至今為止,人們知之甚少。 因此,本課題的主要研究目的是：①檢測(cè)這些梭形癌細(xì)胞與EMT發(fā)生之間的關(guān)系；②檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白在鼻咽癌組織中的表達(dá)情況,分析其表達(dá)與鼻咽癌的侵襲性生物學(xué)行為的關(guān)系,評(píng)估其對(duì)患者預(yù)后的影響；③進(jìn)一步,我們擬通過(guò)表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)篩選出鼻咽癌組織中EMT相關(guān)基因,為深入了解鼻咽癌侵襲和轉(zhuǎn)移惡性進(jìn)程中的具體分子機(jī)制及其生物學(xué)功能奠定堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法 1.通過(guò)免疫組化方法在115例鼻咽癌組織梭形癌細(xì)胞和47例鱗狀癌細(xì)胞中檢測(cè)Pan-cytokeratin(全角蛋白)、E-cadherin(E-鈣粘素)、N-cadherin(巢蛋白)、β-catenin、vimentin(波形蛋白)、fibronectin(纖維粘連蛋白)、Snail、Slug、ALDH1、SOX2、OCT4和Nanog等蛋白的表達(dá)情況；在此基礎(chǔ)上,我們擬進(jìn)一步檢測(cè)梭形癌細(xì)胞的比例與鼻咽癌惡性生物學(xué)行為及預(yù)后的關(guān)系。 2.通過(guò)免疫組化和組織熒光方法檢測(cè)腫瘤出芽和ALDH1在105例鼻咽癌組織中的表達(dá)情況。 1.構(gòu)建包含122例鼻咽癌組織和29例慢性鼻咽炎組織在內(nèi)的組織芯片(TMA)； 2.通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、vimentin和Snail, CSCs相關(guān)蛋白ALDH1、SOX2、OCT4、Nanog和Nestin等蛋白在122例鼻咽癌的表達(dá)情況,分析它們的表達(dá)與臨床病理特征和患者預(yù)后之間的聯(lián)系;組織免疫熒光確證某些EMT或CSCs相關(guān)蛋白的定位表達(dá)。 3.上述EMT和CSCs相關(guān)標(biāo)志物蛋白在122例鼻咽癌組織中進(jìn)行聚類分析。 1.篩選出25例鼻咽癌活檢組織及8例鼻咽正常上皮組織作為芯片實(shí)驗(yàn)對(duì)象,采用北京博奧22KHuman Genome Array人表達(dá)譜基因芯片進(jìn)行芯片檢測(cè)； 2.SAM軟件分析差異表達(dá)基因,qRT-PCR進(jìn)行鑒定。在此基礎(chǔ)上,通過(guò)在線網(wǎng)站進(jìn)行文獻(xiàn)挖掘,篩選出鼻咽癌中與EMT相關(guān)基因,并對(duì)其進(jìn)行GO功能分析、KEGG通路和層次聚類等分析。 結(jié)果 1.與鱗狀癌細(xì)胞比較,Pan-cytokeratin在梭形癌細(xì)胞中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.644)。相反,膜E-cadherin在梭形癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯下調(diào),而β-catenin、N-cadherin、vimentin、fibronectin、Snail、Slug、ALDH1、SOX2、OCT4和Nanog蛋白在梭形癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯上調(diào),兩組間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。此外,在梭形癌細(xì)胞中,膜E-cadherin表達(dá)與漿β-catenin(P0.001)、vimentin (P0.001), fibronectin (P0.001)、Slug (P0.001)、ALDH1(P0.001)OCT4(P0.001)和Nanog(P0.001)表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān),但與N-cadherin (P=0.086)、Snail (P=0.093)和SOX2(P=0.0875)之間的表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)。 有興趣的是,我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),梭形癌細(xì)胞含量與鼻咽癌T分期(P=0.036)、N分期(P=0.031)、臨床分期(P=0.037)、淋巴管浸潤(rùn)(P=0.025)以及生存預(yù)后(P=0.004)有密切關(guān)系。 2.在105例鼻咽癌組織中,腫瘤細(xì)胞低出芽組和高出芽組分別為53例(50.5%)和52例(49.5%)。腫瘤出芽(tumor budding)與腫瘤T分期(P=0.008)、淋巴管浸潤(rùn)(P0.001)、血管浸潤(rùn)(P=0.029)、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P0.001)以及臨床分期(P-0.010)有著密切關(guān)聯(lián)。單因素分析表明,腫瘤出芽高組中患者總體生存率明顯低于低出芽組(P=0.002)。Cox多因素回歸分析表明,腫瘤出芽是影響患者生存預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立因素(P=0.001)。并且,腫瘤出芽ALDH1表達(dá)與腫瘤T分期(P=0.034)、淋巴管浸潤(rùn)(P=0.002)、血管浸潤(rùn)(P=0.017)、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.035)、臨床分期(P0.001)以及總體生存期(P0.001)有著密切關(guān)聯(lián)。 1. E-cadherin胞膜和胞漿表達(dá)均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(分別P0.001和0.005)以及臨床分期(分別P0.001和0.007)有關(guān)聯(lián)。β-catenin胞漿表達(dá)與T分期(P=0.020),淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P0.001)和臨床分期(P=0.036)有關(guān),而β-catenin胞膜表達(dá)與患者的臨床病理參數(shù)均無(wú)關(guān)聯(lián)(P≥0.05)。Vimentin胞核表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P0.001)以及臨床分期進(jìn)展(P0.001)密切相關(guān)。多因素生存分析表明,vimentin核表達(dá)(P=0.016)以及E-cadherin胞漿表達(dá)(P=0.001)是影響患者生存預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)。胞核vimentin/胞漿E-cadherin共表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P0.001)以及臨床分期進(jìn)展(P0.001)密切有關(guān)。更重要的是,胞核vimentin/胞漿E-cadherin共表達(dá)組中患者生存時(shí)間明顯縮短(P0.001)。 2.在122例鼻咽癌組織中,42.6%為N-cadherin胞漿高表達(dá),45.1%為胞核高表達(dá)。N-cadherin胞漿和胞核表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)如淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和臨床分期(P=0.012)均顯著有關(guān)。N-cadheri胞漿和胞核之間表達(dá)水平呈正相關(guān)(P0.001)。然而,N-cadherin胞漿或胞核表達(dá)與E-cadherin之間表達(dá)無(wú)相關(guān)性(P≥0.05)。單因素分析顯示,N-cadherin胞漿表達(dá)高低對(duì)患者生存時(shí)間差異影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≥0.05)。然而,N-cadherin核高表達(dá)組中患者總體生存率明顯低于核表達(dá)低組(P=0.002)。此外,在鼻咽癌臨床晚期(Ⅲ-Ⅳ)患者中,N-cadherin核高表達(dá)組中的總體生存時(shí)間明顯低于表達(dá)低組(P=0.033),但對(duì)Ⅰ-Ⅱ期患者總體生存期影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Cox模型分析表明,N-cadherin胞核表達(dá)可作為一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)(P-0.024)。 3.122例鼻咽癌組織中,46例(37.7%)為Snail胞漿表達(dá),60例(49.2%)為Snail胞核表達(dá)。除了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.042),Snail胞漿表達(dá)與其它臨床病理參數(shù)之間不存在明顯關(guān)聯(lián)。相反,Snail胞核表達(dá)與T分期(P=0.045),N分期(P=0.019),M分期(P=0.046)及臨床分期進(jìn)展(P=0.003)均有顯著關(guān)聯(lián)。此外Snail胞核表達(dá)與E-cadherin胞膜表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P=0.021)。單因素生存分析表明,鼻咽癌患者Snail胞核表達(dá)高組,而不是胞漿高表達(dá)組,其總體生存期明顯低于低表達(dá)組(P0.001)。多因素生存分析表明,Snail核表達(dá)可以獨(dú)立影響鼻咽癌患者的生存預(yù)后(P0.001),尤其是處于臨床Ⅲ-Ⅳ期患者。 4.我們的結(jié)果顯示,SOX2,OCT4和Nanog蛋白在鼻咽癌組織中表達(dá)增高,并且在腫瘤組織侵襲邊緣尤為常見(jiàn),與EMT相關(guān)蛋白(E-cadherin/N-cadherin和Snail)顯著相關(guān)。Nestin在鼻咽癌組織中甚少表達(dá),然而,其在腫瘤組織侵襲邊緣的血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)明顯增高。侵襲邊緣SOX2,OCT4或Nanog表達(dá)高組,患者總體生存率明顯低于各低表達(dá)組(分別P=0.006,0.001和0.000)。多因素生存分析表明,OCT4和Nanog表達(dá)是影響患者預(yù)后的有價(jià)值的獨(dú)立指標(biāo)(分別P=0.006和0.001)。并且,腫瘤侵襲邊緣OCT4/Nanog共表達(dá)組,患者總體生存率明顯低于其它組別(P=0.005)。此外,有興趣的是,在鼻咽癌組織的侵襲邊緣,SOX2,OCT4和Nanog與CSCs標(biāo)記物ALDH1以及血管內(nèi)皮表達(dá)的Nestin蛋白呈顯著正相關(guān)(P0.001)。 5.鼻咽癌組織中侵襲邊緣ALDH1的表達(dá)與患者T分期(P=0.001), M分期(P0.001),臨床分期(P0.001)以及淋巴管浸潤(rùn)(P0.001)有關(guān),組間差異明顯有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在鼻咽癌組織的侵襲邊緣,ALDH1的表達(dá)水平與EMT相關(guān)蛋白如E-cadherin胞漿表達(dá)(P=0.001),vimentin胞核表達(dá)(P0.001)以及Snail(P0.001)存在顯著正相關(guān)。單因素分析顯示,患者腫瘤侵襲邊緣ALDH1高表達(dá)組,其總體生存率明顯降低。然而,多因素生存分析表明,侵襲邊緣ALDH1表達(dá)不是影響患者預(yù)后的獨(dú)立因素。侵襲邊緣ALDH1表達(dá)對(duì)早期鼻咽癌患者(T1-T2,N0-N1)的總體生存率有著重要影響(分別P0.001,P=0.002)。 6.上述EMT和CSCs相關(guān)蛋白將122例鼻咽癌組織聚類成兩大組(Group A和Group B)。與Group A相比,Group B中膜E-cadherin表達(dá)明顯減少,而漿E-cadherin、vimentir、N-cadherin、SnaikOCT4和Nanog等表達(dá)明顯上調(diào)。而且,我們結(jié)果發(fā)現(xiàn),Group B與患者T分期、N分期、M分期、臨床分期的進(jìn)展以及梭形癌細(xì)胞的比例(≥20%)有著密切聯(lián)系。更重要的是,Group B鼻咽癌患者的總體生存率明顯低于Group A組。 1.與鼻咽正常上皮組織比較,鼻咽癌組織中共有509個(gè)差異表達(dá)基因,其中表達(dá)上調(diào)基因306個(gè),表達(dá)下調(diào)基因203個(gè),這些差異基因主要參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),細(xì)胞粘附,蛋白酶水解,細(xì)胞周期,細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡等。 2.通過(guò)專業(yè)文獻(xiàn)挖掘軟件,我們篩選與EMT密切相關(guān)的50個(gè)差異表達(dá)基因,GO功能分析表明,這些基因主要與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié),細(xì)胞粘附,細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo),蛋白酶水解,趨化作用及器官形成等有關(guān)。KEGG通路分析軟件表明,這些鼻咽癌EMT相關(guān)基因主要涉及到Wnt信號(hào)通路,p53信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路等。并且,這些差異表達(dá)基因與鼻咽癌的臨床病理特征如T分期、N分期、M分期和臨床分期密切關(guān)聯(lián)。 結(jié)論 1.鼻咽癌組織中的梭形癌細(xì)胞具有EMT和CSCs特性,其含量與鼻咽癌侵襲和轉(zhuǎn)移進(jìn)程密切相關(guān)；鼻咽癌組織中侵襲邊緣存在腫瘤出芽現(xiàn)象,細(xì)胞具有CSCs特性；我們提出,前者是轉(zhuǎn)移,而后者是早期侵襲的形態(tài)學(xué)風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志。 2.EMT相關(guān)蛋白如vimentin、N-cadherin和Snail, CSCs(?)目關(guān)蛋白如Nanog及OCT4在鼻咽癌組織中異常表達(dá),可作為新的預(yù)測(cè)患者轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)因子。 3.用22K人表達(dá)譜基因芯片在鼻咽癌組織中篩選出50個(gè)與EMT密切相關(guān)的差異表達(dá)基因,它們主要參與Wnt通路,p53通路及MAPK通路等信號(hào)傳導(dǎo)；這些EMT相關(guān)基因可對(duì)鼻咽癌惡性進(jìn)展進(jìn)行分子分型。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R739.63

【引證文獻(xiàn)】

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1 陳俊;14-噻吩基次亞甲基苦參堿抗鼻咽癌作用及機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2013年

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本文編號(hào)：1889088