本文選題：人角膜基質細胞 + 復合膠原凝膠支架�。� 參考：《中國海洋大學》2012年博士論文

【摘要】：角膜位于眼球最前端中央處，是組成眼球外壁的透明纖維膜，主要具有防御和屈光等多種功能。人角膜基質（Human Corneal Stroma，，HCS）層由人角膜基質細胞（HumanCorneal Stromal Cell，HCSC）和200余層膠原纖維層構成，約占角膜厚度的90%，位于角膜上皮層和內皮層之間。各種疾病造成的角膜基質不可逆性混濁是致盲的主要原因，角膜病是僅次于白內障的第二大致盲因素，嚴重影響視力且患者人數(shù)每年還在增加。角膜移植是目前治療角膜盲的主要有效方法，但由于捐獻的角膜供體高度匱乏，無法滿足眾多角膜病患者復明的需求。體外重建的組織工程人角膜組織，作為捐獻角膜的等效替代物，是目前解決角膜供體材料來源缺乏的有效途徑，也是使眾多HCS異常眼病患者復明的希望，更為組織工程全層人角膜的體外重建奠定了基礎，因此急需開展組織工程人角膜基質（Tissue-engineered Human Corneal Stroma，TE-HCS）的體外重建研究。 組織工程角膜就是利用組織工程技術以及生物材料或人工合成材料為載體，將角膜的種子細胞接種在載體支架上進行培養(yǎng)，在體外重建出形態(tài)結構和功能與在體人角膜相近的角膜組織替代物。而TE-HCS體外重建的兩個基本要素分別是HCS種子細胞和載體支架材料。目前，作為角膜基質的種子細胞主要有原代細胞和轉染的永生化細胞，但均存在缺陷并限制了在TE-HCS中的應用。本研究室建立了非轉染、無致瘤性的HCSC細胞系解決了種子細胞來源的這一難題。膠原是構成動物細胞外基質的主要成分，不同種類動物來源的膠原的化學及生物學特征具有高度相似性，同時膠原具有低免疫原性、低毒性、低抗原性，而且來源廣泛，其具有良好的生物相容性和生物可降解性，很早就被應用于組織工程的天然生物材料，本文選用膠原蛋白制備復合膠原凝膠支架作為TE-HCS體外重建的載體支架。 為了檢驗業(yè)已建立的非轉染HCS細胞系細胞用作TE-HCS體外重建種子細胞的可行性，本文對HCSC的細胞屬性及功能進行了進一步鑒定。對第100代HCSC的生長曲線和染色體組型分析檢測結果顯示，培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM/F12（1:1）培養(yǎng)液的HCSC在低密度狀態(tài)下保持樹枝狀，長滿單層時呈纖維樣，細胞生長分裂旺盛，其群體倍增時間為41.44h，其特征性染色體數(shù)目仍然為2n=46。對第100代HCSC的細胞免疫化學鑒定結果顯示，HCSC能夠表達HCSC特異性標志蛋白——波形蛋白；連接蛋白——整聯(lián)蛋白β1和間隙連接蛋白-43的表達為陽性；功能蛋白——乙醛脫氫酶3A1、鈉鉀泵和鈣泵表達為陽性，這表明該細胞仍具有HCSC的細胞屬性、能形成細胞間連接和發(fā)揮功能HCSC的功能。對第100代HCSC的致瘤性檢測結果顯示，該細胞系細胞無致瘤性，可以安全用于TE-HCS的體外重建及其臨床應用研究。可見，業(yè)已建立的非轉染HCS細胞系細胞可被用作TE-HCS體外重建的種子細胞。 為了獲得TE-HCS體外重建的理想載體支架，本文利用人源Ⅰ型、V型和Ⅳ型膠原蛋白以及人源纖連蛋白和硫酸軟骨素為原料，以EDC/NHS（1-[3-二甲基氨基丙基]-3-乙基碳化二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺）為交聯(lián)劑制備了復合膠原凝膠（COL-CS-Gel）支架，并根據(jù)不同類型膠原的所占總膠原量的比例做了不同的組合。通過石蠟切片蘇木精-伊紅（HE）染色、掃描電鏡對制備的復合膠原凝膠支架進行了鑒定。結果顯示：COL-CS-Gel1（組1）表面具有一定的空隙結構，內部結構松散；COL-CS-Gel2表面錯落相疊壓，沒有規(guī)則的空隙，內部結構有連接，但不均勻；COL-CS-Gel3表面結構致密，沒有形成空隙，內部結構不均勻；COL-CS-Gel4表面具有一定的空隙結構，但沒有形成完整的孔隙，內部結構均勻；COL-CS-Gel5表面孔徑在100μm左右，內部結構均勻，是最佳的一個組合。另外對COL-CS-Gel5進行了鑒定，結果表明其透光性良好，透光率在90%左右，含水量為89.3%±4%。因此，COL-CS-Gel5適合用于TE-HCS體外重建。 為了檢測所制備COL-CS-Gel5的最適細胞遷入時間及生物相容性，本文通過冰凍切片HE染色及組織免疫化學方法對其進行了鑒定。在接種3d、5d、7d及9d后，HCSC在支架內部遷入良好、均勻分布。免疫化學鑒定顯示HCSC中波形蛋白、整聯(lián)蛋白β1、間隙連接蛋白-43、乙醛脫氫酶3A1、鈉鉀泵、鈣泵等表達為陽性，說明COL-CS-Gel5與HCSC的生物相容性較好，可以用于TE-HCS體外重建。 為了建立TE-HCS的體外重建的方法，本文利用生長狀態(tài)良好、非轉染、無致瘤性的HCSC為種子細胞，以復合膠原凝膠COL-CS-Gel5為載體支架，使用含10%胎牛血清的DMEM/F12（1:1）培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)條件下，進行了TE-HCS的體外重建研究，并利用冰凍切片HE染色、免疫化學、掃描電鏡和透射電鏡等方法對重建TE-HCS的形態(tài)結構、潛在功能等方面進行了鑒定。結果顯示在培養(yǎng)3d后，細胞在重建TE-HCS內均勻分布，細胞平展于膠原面上，并多處形成細胞-基質之間的連接。同時，細胞-細胞間也存在細胞連接。免疫化學鑒定顯示波形蛋白、整聯(lián)蛋白β1、間隙連接蛋白-43、乙醛脫氫酶3A1、鈉鉀泵、鈣泵等表達為陽性。這表明體外重建的TE-HCS具有與正常角膜基質相似的形態(tài)結構，且體外重建的TE-HCS具有發(fā)揮HCS生物學功能的潛能。最后，對所得TE-HCS利用新西蘭兔角膜基質移植進行了初步的功能檢測，在體觀察到10d。 綜上所述，第100代非轉染HCSC生長狀態(tài)良好、增殖分裂旺盛；染色體特征正常；HCSC的標志性蛋白、連接蛋白、功能蛋白表達為陽性，且無致瘤性。同時，利用人源Ⅰ型、V型和Ⅳ型膠原蛋白以及人源纖連蛋白和硫酸軟骨素為原料，以EDC/NHS為交聯(lián)劑制備的復合膠原凝膠支架COL-CS-Gel5對HCSC的生物相容性好。然后利用本研究室所建立的非轉染、無致瘤性HCSC及新制備的復合膠原凝膠支架COL-CS-Gel5成功體外構建出了TE-HCS。
[Abstract]:Human corneal stroma ( HCS ) is a major effective method to treat corneal stroma .

The tissue engineering cornea is used as the carrier of tissue engineering technology and biological material or synthetic material , and the seed cells of cornea are seeded onto the carrier support for culture . The two basic elements of the in vitro reconstruction of TE - HCS are HCS seed cells and carrier scaffold materials .

In order to verify the feasibility of the non - transfected HCS cell line cells which have been established as TE - HCS in vitro , the cell properties and functions of HCSCs were further identified . The results showed that HCSCs cultured in DMEM / F12 ( 1 : 1 ) medium containing 10 % fetal bovine serum were cultured in low density .
The expression of connexin _ integrin 尾1 and gap junction protein - 43 was positive .
Functional protein _ acetaldehyde dehydrogenase 3A1 , sodium - potassium pump and calcium pump were expressed as positive , indicating that the cell still has the cell properties of HCSC , which can form intercellular connection and function HCSC . The results of tumor - induced detection of HCSC in the first generation showed that the cell line cells had no genicity and could be safely used in vitro reconstruction of TE - HCS and its clinical application . It was found that the non - transfected HCS cell line cells which have been established can be used as the seed cells for the in vitro reconstruction of TE - HCS .

In order to obtain the ideal carrier scaffold for the in vitro reconstruction of TE - HCS , the composite collagen gel ( COL - CS - Gel ) stent was prepared by using human source I , V and IV collagen as well as human fibronectin and chondroitin sulfate as cross - linking agent .
The surface of COL - CS - Gel2 surface is overlapped , there is no regular gap , the internal structure is connected , but it is not uniform ;
The surface structure of COL - CS - Gel3 is compact , no voids are formed , and the internal structure is not uniform ;
The surface of COL - CS - Gel4 has a certain void structure , but it does not form complete pores , and the internal structure is uniform ;
COL - CS - Gel5 is suitable for the in vitro reconstruction of TE - HCS . COL - CS - Gel5 is suitable for the in vitro reconstruction of TE - HCS .

In order to detect the optimal cell migration time and biocompatibility of COL - CS - Gel5 , it was identified by HE staining and tissue immunochemistry method . After 3 days , 5 d , 7 d and 9 d , the HCSC migrated well and evenly in the stent . The immunochemical identification showed that the expression of wave - protein , integrin 尾1 , gap junction protein - 43 , acetaldehyde dehydrogenase 3A1 , sodium - potassium pump and calcium pump were positive in HCSC , indicating that COL - CS - Gel5 had better biocompatibility with HCSC , and could be used for the in vitro reconstruction of TE - HCS .

In order to establish a method for the in vitro reconstruction of TE - HCS , the cells were cultured in DMEM / F12 ( 1 : 1 ) culture medium containing 10 % fetal bovine serum at 37 鈩

本文編號：1823314