本文選題：人角膜基質(zhì)細(xì)胞 + 復(fù)合膠原凝膠支架�。� 參考：《中國(guó)海洋大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：角膜位于眼球最前端中央處，是組成眼球外壁的透明纖維膜，主要具有防御和屈光等多種功能。人角膜基質(zhì)（Human Corneal Stroma，，HCS）層由人角膜基質(zhì)細(xì)胞（HumanCorneal Stromal Cell，HCSC）和200余層膠原纖維層構(gòu)成，約占角膜厚度的90%，位于角膜上皮層和內(nèi)皮層之間。各種疾病造成的角膜基質(zhì)不可逆性混濁是致盲的主要原因，角膜病是僅次于白內(nèi)障的第二大致盲因素，嚴(yán)重影響視力且患者人數(shù)每年還在增加。角膜移植是目前治療角膜盲的主要有效方法，但由于捐獻(xiàn)的角膜供體高度匱乏，無(wú)法滿足眾多角膜病患者復(fù)明的需求。體外重建的組織工程人角膜組織，作為捐獻(xiàn)角膜的等效替代物，是目前解決角膜供體材料來(lái)源缺乏的有效途徑，也是使眾多HCS異常眼病患者復(fù)明的希望，更為組織工程全層人角膜的體外重建奠定了基礎(chǔ)，因此急需開(kāi)展組織工程人角膜基質(zhì)（Tissue-engineered Human Corneal Stroma，TE-HCS）的體外重建研究。 組織工程角膜就是利用組織工程技術(shù)以及生物材料或人工合成材料為載體，將角膜的種子細(xì)胞接種在載體支架上進(jìn)行培養(yǎng)，在體外重建出形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能與在體人角膜相近的角膜組織替代物。而TE-HCS體外重建的兩個(gè)基本要素分別是HCS種子細(xì)胞和載體支架材料。目前，作為角膜基質(zhì)的種子細(xì)胞主要有原代細(xì)胞和轉(zhuǎn)染的永生化細(xì)胞，但均存在缺陷并限制了在TE-HCS中的應(yīng)用。本研究室建立了非轉(zhuǎn)染、無(wú)致瘤性的HCSC細(xì)胞系解決了種子細(xì)胞來(lái)源的這一難題。膠原是構(gòu)成動(dòng)物細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，不同種類動(dòng)物來(lái)源的膠原的化學(xué)及生物學(xué)特征具有高度相似性，同時(shí)膠原具有低免疫原性、低毒性、低抗原性，而且來(lái)源廣泛，其具有良好的生物相容性和生物可降解性，很早就被應(yīng)用于組織工程的天然生物材料，本文選用膠原蛋白制備復(fù)合膠原凝膠支架作為T(mén)E-HCS體外重建的載體支架。 為了檢驗(yàn)業(yè)已建立的非轉(zhuǎn)染HCS細(xì)胞系細(xì)胞用作TE-HCS體外重建種子細(xì)胞的可行性，本文對(duì)HCSC的細(xì)胞屬性及功能進(jìn)行了進(jìn)一步鑒定。對(duì)第100代HCSC的生長(zhǎng)曲線和染色體組型分析檢測(cè)結(jié)果顯示，培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM/F12（1:1）培養(yǎng)液的HCSC在低密度狀態(tài)下保持樹(shù)枝狀，長(zhǎng)滿單層時(shí)呈纖維樣，細(xì)胞生長(zhǎng)分裂旺盛，其群體倍增時(shí)間為41.44h，其特征性染色體數(shù)目仍然為2n=46。對(duì)第100代HCSC的細(xì)胞免疫化學(xué)鑒定結(jié)果顯示，HCSC能夠表達(dá)HCSC特異性標(biāo)志蛋白——波形蛋白；連接蛋白——整聯(lián)蛋白β1和間隙連接蛋白-43的表達(dá)為陽(yáng)性；功能蛋白——乙醛脫氫酶3A1、鈉鉀泵和鈣泵表達(dá)為陽(yáng)性，這表明該細(xì)胞仍具有HCSC的細(xì)胞屬性、能形成細(xì)胞間連接和發(fā)揮功能HCSC的功能。對(duì)第100代HCSC的致瘤性檢測(cè)結(jié)果顯示，該細(xì)胞系細(xì)胞無(wú)致瘤性，可以安全用于TE-HCS的體外重建及其臨床應(yīng)用研究�？梢�(jiàn)，業(yè)已建立的非轉(zhuǎn)染HCS細(xì)胞系細(xì)胞可被用作TE-HCS體外重建的種子細(xì)胞。 為了獲得TE-HCS體外重建的理想載體支架，本文利用人源Ⅰ型、V型和Ⅳ型膠原蛋白以及人源纖連蛋白和硫酸軟骨素為原料，以EDC/NHS（1-[3-二甲基氨基丙基]-3-乙基碳化二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺）為交聯(lián)劑制備了復(fù)合膠原凝膠（COL-CS-Gel）支架，并根據(jù)不同類型膠原的所占總膠原量的比例做了不同的組合。通過(guò)石蠟切片蘇木精-伊紅（HE）染色、掃描電鏡對(duì)制備的復(fù)合膠原凝膠支架進(jìn)行了鑒定。結(jié)果顯示：COL-CS-Gel1（組1）表面具有一定的空隙結(jié)構(gòu)，內(nèi)部結(jié)構(gòu)松散；COL-CS-Gel2表面錯(cuò)落相疊壓，沒(méi)有規(guī)則的空隙，內(nèi)部結(jié)構(gòu)有連接，但不均勻；COL-CS-Gel3表面結(jié)構(gòu)致密，沒(méi)有形成空隙，內(nèi)部結(jié)構(gòu)不均勻；COL-CS-Gel4表面具有一定的空隙結(jié)構(gòu)，但沒(méi)有形成完整的孔隙，內(nèi)部結(jié)構(gòu)均勻；COL-CS-Gel5表面孔徑在100μm左右，內(nèi)部結(jié)構(gòu)均勻，是最佳的一個(gè)組合。另外對(duì)COL-CS-Gel5進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明其透光性良好，透光率在90%左右，含水量為89.3%±4%。因此，COL-CS-Gel5適合用于TE-HCS體外重建。 為了檢測(cè)所制備COL-CS-Gel5的最適細(xì)胞遷入時(shí)間及生物相容性，本文通過(guò)冰凍切片HE染色及組織免疫化學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行了鑒定。在接種3d、5d、7d及9d后，HCSC在支架內(nèi)部遷入良好、均勻分布。免疫化學(xué)鑒定顯示HCSC中波形蛋白、整聯(lián)蛋白β1、間隙連接蛋白-43、乙醛脫氫酶3A1、鈉鉀泵、鈣泵等表達(dá)為陽(yáng)性，說(shuō)明COL-CS-Gel5與HCSC的生物相容性較好，可以用于TE-HCS體外重建。 為了建立TE-HCS的體外重建的方法，本文利用生長(zhǎng)狀態(tài)良好、非轉(zhuǎn)染、無(wú)致瘤性的HCSC為種子細(xì)胞，以復(fù)合膠原凝膠COL-CS-Gel5為載體支架，使用含10%胎牛血清的DMEM/F12（1:1）培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)條件下，進(jìn)行了TE-HCS的體外重建研究，并利用冰凍切片HE染色、免疫化學(xué)、掃描電鏡和透射電鏡等方法對(duì)重建TE-HCS的形態(tài)結(jié)構(gòu)、潛在功能等方面進(jìn)行了鑒定。結(jié)果顯示在培養(yǎng)3d后，細(xì)胞在重建TE-HCS內(nèi)均勻分布，細(xì)胞平展于膠原面上，并多處形成細(xì)胞-基質(zhì)之間的連接。同時(shí)，細(xì)胞-細(xì)胞間也存在細(xì)胞連接。免疫化學(xué)鑒定顯示波形蛋白、整聯(lián)蛋白β1、間隙連接蛋白-43、乙醛脫氫酶3A1、鈉鉀泵、鈣泵等表達(dá)為陽(yáng)性。這表明體外重建的TE-HCS具有與正常角膜基質(zhì)相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)，且體外重建的TE-HCS具有發(fā)揮HCS生物學(xué)功能的潛能。最后，對(duì)所得TE-HCS利用新西蘭兔角膜基質(zhì)移植進(jìn)行了初步的功能檢測(cè)，在體觀察到10d。 綜上所述，第100代非轉(zhuǎn)染HCSC生長(zhǎng)狀態(tài)良好、增殖分裂旺盛；染色體特征正常；HCSC的標(biāo)志性蛋白、連接蛋白、功能蛋白表達(dá)為陽(yáng)性，且無(wú)致瘤性。同時(shí)，利用人源Ⅰ型、V型和Ⅳ型膠原蛋白以及人源纖連蛋白和硫酸軟骨素為原料，以EDC/NHS為交聯(lián)劑制備的復(fù)合膠原凝膠支架COL-CS-Gel5對(duì)HCSC的生物相容性好。然后利用本研究室所建立的非轉(zhuǎn)染、無(wú)致瘤性HCSC及新制備的復(fù)合膠原凝膠支架COL-CS-Gel5成功體外構(gòu)建出了TE-HCS。
[Abstract]:Human corneal stroma ( HCS ) is a major effective method to treat corneal stroma .

The tissue engineering cornea is used as the carrier of tissue engineering technology and biological material or synthetic material , and the seed cells of cornea are seeded onto the carrier support for culture . The two basic elements of the in vitro reconstruction of TE - HCS are HCS seed cells and carrier scaffold materials .

In order to verify the feasibility of the non - transfected HCS cell line cells which have been established as TE - HCS in vitro , the cell properties and functions of HCSCs were further identified . The results showed that HCSCs cultured in DMEM / F12 ( 1 : 1 ) medium containing 10 % fetal bovine serum were cultured in low density .
The expression of connexin _ integrin 尾1 and gap junction protein - 43 was positive .
Functional protein _ acetaldehyde dehydrogenase 3A1 , sodium - potassium pump and calcium pump were expressed as positive , indicating that the cell still has the cell properties of HCSC , which can form intercellular connection and function HCSC . The results of tumor - induced detection of HCSC in the first generation showed that the cell line cells had no genicity and could be safely used in vitro reconstruction of TE - HCS and its clinical application . It was found that the non - transfected HCS cell line cells which have been established can be used as the seed cells for the in vitro reconstruction of TE - HCS .

In order to obtain the ideal carrier scaffold for the in vitro reconstruction of TE - HCS , the composite collagen gel ( COL - CS - Gel ) stent was prepared by using human source I , V and IV collagen as well as human fibronectin and chondroitin sulfate as cross - linking agent .
The surface of COL - CS - Gel2 surface is overlapped , there is no regular gap , the internal structure is connected , but it is not uniform ;
The surface structure of COL - CS - Gel3 is compact , no voids are formed , and the internal structure is not uniform ;
The surface of COL - CS - Gel4 has a certain void structure , but it does not form complete pores , and the internal structure is uniform ;
COL - CS - Gel5 is suitable for the in vitro reconstruction of TE - HCS . COL - CS - Gel5 is suitable for the in vitro reconstruction of TE - HCS .

In order to detect the optimal cell migration time and biocompatibility of COL - CS - Gel5 , it was identified by HE staining and tissue immunochemistry method . After 3 days , 5 d , 7 d and 9 d , the HCSC migrated well and evenly in the stent . The immunochemical identification showed that the expression of wave - protein , integrin 尾1 , gap junction protein - 43 , acetaldehyde dehydrogenase 3A1 , sodium - potassium pump and calcium pump were positive in HCSC , indicating that COL - CS - Gel5 had better biocompatibility with HCSC , and could be used for the in vitro reconstruction of TE - HCS .

In order to establish a method for the in vitro reconstruction of TE - HCS , the cells were cultured in DMEM / F12 ( 1 : 1 ) culture medium containing 10 % fetal bovine serum at 37 鈩

本文編號(hào)：1823314