本文選題：恒河猴視網(wǎng)膜脈絡膜內皮細胞 + 脈絡膜新生血管��； 參考：《天津醫(yī)科大學》2012年碩士論文

【摘要】：目的：本研究通過測定塞來昔布(Celecoxib)、氨芬酸(Amfenac)及曲安奈德(Triamcinolone acetonideon)對VEGF165誘導RF/6A細胞的增殖抑制率及細胞劃痕修復實驗、細胞分裂周期、前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)分泌量及環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase-2, COX-2) mRNA. VEGF受體-2(VEGF receptor-2, KDR) mRNA、基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)mRNA、基質金屬蛋白酶組織抑制劑-2、-3(tissue inhibitor of metalloproteinase-2、-3, TIMP-2、TIMP-3) mRNA的相對表達量的影響,研究并比較上述藥物對RF/6A細胞增殖及遷移行為的抑制作用差異及機制。方法：本研究分為正常對照組、VEGF165作用組、VEGF165+Celecoxib組、VEGF165+Amfenac組、VEGF165+TA組,每組設6個復孔,實驗重復測量3次,取平均值。 1、RF/6A單細胞懸液(細胞數(shù)約1×104/m1)接種至96孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)24h后,棄上清；用僅含有終濃度為25ng/ml的VEGF165及VEGF165聯(lián)合三種藥物IC50濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞24h、48h、72h分別行MTT實驗測定細胞增殖抑制率。棄20μl培養(yǎng)液后,于測試前4h每孔加入等量MTT (5mg/ml)孵育4h,終止培養(yǎng)；棄液加入DMSO150μl,振蕩5min,使紫色結晶完全溶解,于酶標儀測定570nm處吸光值A,計算細胞增殖抑制率并推算藥物的IC50值。細胞抑制率=1-實驗組A值/對照組A值 2、將RF/6A細胞以1×106/ml密度接種于六孔細胞培養(yǎng)板內,進行細胞劃痕修復實驗。利用無菌10μltip槍頭在孔中央對細胞作一條約0.8mm的劃痕,更換正常或含有相應藥物的培養(yǎng)基,溫箱培育48h后觀察劃痕兩側的細胞間距離變化(μm),低倍鏡下(×40)拍照,利用Image Pro-Plus圖像處理軟件測量“裸區(qū)”面積,利用Image J圖像處理器分析“裸區(qū)”像素前后改變,測定三種藥物對VEGF165誘導下細胞遷移能力的影響。 3、將不同處理組的細胞消化后調整細胞數(shù)量1×105/ml的單細胞懸液,離心后,70%乙醇固定,4℃放置過夜,加入RNA酶,濃度為50μg/ml,37℃水浴30min,加入PI染液并使最終濃度為100μg/ml,避光30minDNA染色,利用流式細胞儀測定三種藥物對正常及VEGF165誘導下RF/6A細胞分裂周期的影響。 4、酶聯(lián)免疫吸附法測定三種藥物對VEGF165誘導下RF/6A細胞PGE2的分泌量的影響：按照比例稀釋原倍標準品,設立空白孔調零后,450nm波長依次測量各孔吸光度OD值,利用標準品與吸光度之間的回歸方程,測量相應吸光度OD值對應的含量。 5、實時熒光定量PCR (RT-PCR)法檢測三種藥物對VEGF165誘導下RF/6A細胞COX-2mRNA、KDRmRNA、 MMP-2mRNA、 TIMP-2mRNA、 TIMP-3mRNA的相對表達量差異：采用trizol法提取RNA、比較閾值法測定mRNA的相對表達量。 統(tǒng)計方法：計量資料采用均數(shù)±標準差；組間比較采用獨立樣本t檢驗及單因素方差分析；組內兩兩比較采用Dunnett t檢驗及LSD檢驗；相關性分析采用pearson相關性分析,P0.05為差異具有顯著性。 結果1、celecoxib對正常RF/6A細胞增殖的抑制率及ICso值測定celecoxib作用于正常RF/6A細胞24h、48h、72h組的吸光度A值經(jīng)差異行組間單因素方差分析顯示差異具有顯著性(F=4.76、3.88、4.29,P0.05),Dunnett檢驗對照組與各濃度組的吸光度A值差異,除24h及72h兩組內0.01μm/l差異無顯著性(T=2.34、1.89,p0.05),其余組間差異具有顯著性；對照組及不同濃度組吸光度A值經(jīng)單因素方差分析顯示,除對照組差異無顯著性(F=1.29,p0.05),其余濃度組差異均有統(tǒng)計學意義,行LSD檢驗顯示,0.1及0.01μm/l濃度組的48h與72h的吸光度A值差別無統(tǒng)計學差異(q=3.04、3.33,p0.05),其余濃度組內不同時間點差異均有統(tǒng)計學差異(P0.05)。吸光度A值隨時間增加而增加,具有時間依賴性。選擇48h為后續(xù)實驗的觀察點,藥物的IC50值為17.33μm/1。 2、 Amfenac對正常RF/6A細胞增殖的抑制率及ICso值測定Amfenac作用正常RF/6A細胞24h、48h、72h組的吸光度A值經(jīng)差異行組間單因素方差分析顯示差異具有顯著性(F=3.98、4.62、4.01,P0.05),Dunnet t檢驗各濃度組的吸光度A值差異顯示,除72h組內0.1μm/l、0.01μm/l的吸光度A值與對照組差異無顯著性(T=2.02,p0.05),其余相同組間不同濃度吸光度A值差異具有顯著性；對照組及不同濃度組吸光度A值經(jīng)單因素方差分析顯示,對照組差異無顯著性(F=2.12,p0.05),其余濃度組差異均有統(tǒng)計學意義,行LSD檢驗顯示,除0.01μm/l濃度組內48h與72h的吸光度A值差別無統(tǒng)計學差異(q=4.42,p0.05),其余各濃度組內不同時間組差異均有統(tǒng)計學差異(P0.05)。吸光度A值隨時間增加而增加,具有時間依賴性。選擇48h為后續(xù)實驗的觀察點,藥物的IC50值為17.33μm/1。 3、 Celecoxib及Amfenac不同濃度的細胞抑制率比較： 抑制率48h細胞抑制率經(jīng)獨立樣本t檢驗顯示,差值均有統(tǒng)計學意義(p0.05),48h時間點Amfenac對RF/6A細胞的抑制率較Celecoxib明顯。 4、48h Celecoxib、Amfenac及TA對VEGF165誘導RF/6A細胞的吸光度A值及細胞抑制率比較 不同實驗組的吸光度A值經(jīng)單因素方差分析表明差異具有顯著性(F=65.62,p=0.000)。各實驗組與對照組的吸光度A值差異行Dunnett t檢驗顯示,差異具有顯著性(p0.05),VEGF165組吸光度A值高于對照組；不同實驗組抑制率行單因素方差分析顯示差異具有顯著性(F=69.38,p=0.000),行LSD檢驗顯示三組藥物對細胞的抑制率均有差異(p=0.000、0.000、0.019)。 5、 Celecoxib、 Amfenac及TA對細胞劃痕修復實驗比較 對細胞劃痕修復實驗前后“裸區(qū)”面積變化像素差異行單因素方差分析顯示組間差異具有顯著性(F=536.427,p=0.000)：行Dunnett t檢驗差異具有顯著性,其中VEGF165組像素值高于對照組(p=0.011)；實驗組行LSD檢驗行組間兩兩比較差異具有顯著性(p=0.000、0.001、0.000),其中VEGF165+Celecoxib組的像素降低最為明顯,其次為VEGF165+TA組及VEGF165+Amfenac組。 6、Celecoxib、 Amfenac及TA對正常及VEGF165誘導RF/6A細胞周期的影響 Celecoxib、 Amfenac及TA對正常RF/6A細胞分裂周期G1、S期所占細胞周期比例經(jīng)單因素方差分析顯示差異具有顯著性(F=107.613、1156.981,P=0.000、0.000)；Dunnett t檢驗顯示實驗組與各對照組細胞所占百分比差異具有顯著性(p=0.001、0.000)；行LSD檢驗進行組間兩兩比較顯示,除Celecoxib組與TA組對G1期、S期所占細胞周期比例差異無顯著性(p=0.143),其余組均具有統(tǒng)計學意義。 Celecoxib、 Amfenac及TA對VEGF165誘導RF/6A細胞分裂周期G1、S期所占細胞周期比例經(jīng)單因素方差分析顯示差異具有顯著性(P0.05);Dunnett t檢驗顯示各實驗組與對照組細胞所占百分比差異具有顯著性(p=0.001、0.000)；行LSD檢驗進行組間兩兩比較顯示,除Celecoxib組與TA組對G1期、S期所占細胞周期比例差異無顯著性(p=0.630),其余組均具有統(tǒng)計學意義。7、 Celecoxib、 Amfenac及TA對VEGF165誘導下RF/6A細胞PGE2分泌量的影響 經(jīng)對數(shù)曲線回歸分析得出樣品與吸光度之間的回歸方程：樣品量=-45.478+424.557吸光度；回歸模型經(jīng)單因素方差檢驗,具有統(tǒng)計學意義(F=3008.818,p=0.000),R=0.994；R2=0.987,顯示曲線擬合良好。對不同處理組中RF/6A細胞PGE2表達量行單因素方差分析差異具有顯著性(p0.05)；VEGF165組與實驗組行Dunnett t檢驗比較顯示,與對照組的表達量差異具有顯著性(p=0.000、0.000、0.000),VEGF165可誘導RF/6A細胞的PGE2表達量較各實驗組增加；各實驗PGE2表達量差異行LSD檢驗顯示差異具有顯著性(p0.05),VEGF165+Celecoxib組PGE2表達量低于VEGF165+Amfenac組及VEGF165+TA組(p=0.034、0.011)。8, RT-PCR法測定藥物作用于VEGF165誘導下的細胞表達COX-2、KDR、MMP-2、TIMP-2、 TIMP-3mRNA相對表達量瓊脂糖凝膠電泳鑒定結果：各組樣本均可見28S和18S兩個清晰條帶,28S/18S比值約為2：1,提示提取的RNA比較完整,未見明顯降解。組間各因子mRNA的相對表達量行單因素方差分析顯示差異具有顯著性；各實驗組與VEGF165組相對表達量差異行Dunnuet t檢驗顯示,除VEGF165組誘導細胞KDRmRNA的相對表達量與VEGF165+Amfenac及VEGF165+TA組無統(tǒng)計學差異(P=0.655、0.459),其余因子的相對表達量與VEGF165組的差異均具有顯著性(p0.05);實驗組各因子mRNA表達量行LSD檢驗VEGF165+Celecoxib與VEGF165+Amfenac兩組間COX-2mRNA的相對表達量差異無顯著性、VEGF165+Amfenac與VEGF165+TA兩組MMP-2、TIMP-2、 TIMP-3、 KDRmRNA的相對表達量差異無顯著性(p0.05),其余兩兩組間各因子的相對表達量差異均有統(tǒng)計學意義(p0.05)。 PGE2表達量與COX-2mRNA行pearson線性相關性分析,結果顯示二者成明顯正相關(R=0.851,p0.01)；MMP-2、TIMP-2、 TIMP-3mRNA的相對表達量與COX-2mRNA的相對表達量行pearson線性相關性分析表明上述三因子分別與COX-2具有明顯正相關(R=0.806、0.892、0.897,p0.01)。 各實驗組MMP-2mRNA:TIMP-2mRNA比值行單因素方差分析顯示實驗組間比值差異具有顯著性(F=6.838,P=0.013)；行LSD檢驗行表明VEGF165+Celecoxib組的比值低于其余組別(P=0.045、0.003、0.008)。KDRmRNA與細胞遷移前后“裸區(qū)”面積變化像素值行pearson相關性分析顯示二者具有明顯正相關性(R=0.544,p=0.031) 結論 1. Celecoxib、 Amfenac及TA可抑制VEGF165誘導的RF/6A細胞增殖,其機制為增加G1期、降低S期所占細胞周期比重,Amfenac的抑制作用強于Celecoxib及TA。 2. Celecoxib、 Amfenac及TA可抑制VEGF165誘導的RF/6A細胞遷移,但抑制機制不同。 Celecoxib通過抑制COX-2-PGE2-MMPs系統(tǒng)、降低MMP-2：TIMP-2比值及KDRmRNA的相對表達量抑制細胞遷移,Amfenac及TA通過抑制COX-2-PGE2-MMPs系統(tǒng)抑制細胞遷移,Celecoxib作用強于Amfenac及TA。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R774.1

【參考文獻】

相關期刊論文 前9條

1 李偉忠;王曉燕;丁彥青;;塞來昔布抑制Tca8113釋放PGE2及與COX-2、VEGF-C mRNA表達的相關性研究[J];南方醫(yī)科大學學報;2009年03期

2 許建華;劉哲麗;李若溪;孔偉;張薇;;曲安奈德對缺氧條件下恒河猴脈絡膜視網(wǎng)膜內皮細胞VEGF表達的影響[J];國際眼科雜志;2006年05期

3 高小燕;何守志;;曲安奈德抑制BN大鼠脈絡膜新生血管生長[J];國際眼科雜志;2010年08期

4 曾愛萍;曾水清;程揚;肖青;李鵬程;;人視網(wǎng)膜色素上皮細胞中MMP-2和TIMP-1表達的調節(jié)[J];華中科技大學學報(醫(yī)學版);2006年03期

5 劉雪霞;吳海洋;陶海;;MMP/TIMP系統(tǒng)與玻璃體視網(wǎng)膜疾病的研究進展[J];眼科新進展;2007年02期

6 蔡巖;王雨生;徐建鋒;石圓圓;張朝霞;馬吉獻;;玻璃體內注射塞來昔布對激光誘導大鼠脈絡膜新生血管的抑制作用[J];眼科研究;2009年11期

7 鄒明,張軍軍;曲安奈德對正常人視網(wǎng)膜色素上皮細胞毒性的體外研究[J];中華眼底病雜志;2005年04期

8 陳向武;袁非;靳婧;;氧誘導視網(wǎng)膜病模型中曲安奈德抑制新生血管生長的機制[J];中國實驗動物學報;2011年04期

9 李亞萍;王玲;蘇冠方;孫大軍;劉早霞;吳雅臻;;老年黃斑變性脈絡膜新生血管膜的增殖活性[J];中國老年學雜志;2009年07期

相關碩士學位論文 前1條

1 馬敏旺;沙利度胺抑制細胞增殖和脈絡膜新生血管的實驗研究[D];天津醫(yī)科大學;2006年

，

本文編號：1804042