本文選題：SD大鼠 + 螺旋神經(jīng)節(jié)細胞　； 參考：《華中科技大學》2015年博士論文

【摘要】：第一部分SD大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的原代培養(yǎng)及鑒定 目的新生SD大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞(spiral ganglion neurons, SGN)的體外原代培養(yǎng)及鑒定。 方法出生1-3天的SD大鼠乳鼠在75%酒精中麻醉5分鐘后斷頭,在解剖顯微鏡下移去雙側(cè)顳骨并打開聽泡,并取出耳蝸蝸軸內(nèi)組織,分離基底膜及血管紋組織,暴露螺旋神經(jīng)組織。在37℃下0.25%胰酶消化螺旋神經(jīng)組織30分鐘并制成細胞懸液后接種于12孔板培養(yǎng)板,5%CO2/95%O2.37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。SGN使用含10%神經(jīng)營養(yǎng)因子(B27)的DMEM/F12神經(jīng)細胞培養(yǎng)基,加入5μmol/l的阿糖胞苷純化細胞24、48、72h后爬片,鑒定采用TUJ1(Santa Cruz, USA)和NeuN (abcam,USA)抗體,應用普通光鏡和激光共聚焦免疫熒光的方法觀察、鑒定培養(yǎng)的細胞。 結(jié)果在普通光學顯微鏡下觀察到SGN接種6小時后貼壁生長,早期細胞軸突不明顯,后期形成長長的雙極或三極軸突,胞體呈亮度較高的“橢圓形”(見圖1-1)。采用低濃度阿糖胞苷藥物能去除大部分成纖維細胞,72h純化程度最高,螺旋細胞死亡不明顯。激光共聚焦免疫熒光發(fā)現(xiàn)抗體主要表達在細胞膜及軸突(見圖1-2,3)。 結(jié)論利用胰酶消化法可以成功的進行SD大鼠乳鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的原代培養(yǎng),5μmol/l阿糖胞苷純化72h后可得到純度較高的螺旋神經(jīng)節(jié)細胞,并可以用神經(jīng)細胞特異性抗體NeuN和TUJ1鑒定。 第二部分模擬手機電磁輻射對正常螺旋神經(jīng)節(jié)細胞損傷的研究 目的研究常用手機頻率1800MHz,強度SAR(2和4W/kg)下電磁輻射對螺旋神經(jīng)節(jié)細胞DNA損傷、超微結(jié)構(gòu)改變、自噬及ROS生成的相關(guān)研究。 方法正常螺旋神經(jīng)節(jié)細胞暴露于1800MHz電磁輻射系統(tǒng),輻射強度分別設(shè)定為2和4W/kg,選擇開5分鐘關(guān)10分鐘的“手機通話模式”,暴露時間為24小時。采用單個細胞電泳(彗星實驗)觀察電磁輻射對細胞DNA有無損傷,以H202作為陽性對照；投射電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)改變(線粒體、細胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等)；免疫熒光的方法在激光共聚焦顯微鏡下觀察自噬相關(guān)蛋白Beclinl和LC3-Ⅱ的表達。DCFH-DA試劑盒檢測ROS生成。 結(jié)果在2和4W/kg強度下,彗星實驗結(jié)果均陰性(見圖2-1)。投射電鏡下線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞核及細胞膜等結(jié)構(gòu)未見明顯異常(見圖2-2),未見溶酶體及自噬小體。4W/kg強度下僅有LC3-Ⅱ蛋白少量表達(見圖2-3)：4W/kg和H202組ROS生成量高于對照和2W/kg輻射組(p0.05,0.01)(見圖2-4)。 結(jié)論短期暴露模式下模擬手機電磁輻射不能直接引起細胞DAN損傷；細胞超微結(jié)構(gòu)未見顯著改變;在該暴露模式下自噬作用不明顯；4W/kg條件下ROS生成量高于對照和2W/kg輻射組。電磁輻射產(chǎn)生生物學效應的機制之一可能與ROS系統(tǒng)激活有關(guān)。 第三部分模擬手機電磁輻射對脂多糖誘導的病理狀態(tài)下SD大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞損傷的研究 目的研究當螺旋神經(jīng)節(jié)細胞處于病理狀態(tài)下時,細胞對手機電磁輻射引起損傷敏感性的變化。 方法螺旋神經(jīng)節(jié)細胞接受不同濃度的脂多糖(0,20,40,50,100,200,400μg/ml)處理后,采用CCK-8及彗星實驗(ph13)以篩選出適宜的濃度作為輻射前細胞預處理濃度(即在該濃度下細胞活力正常,DNA未見損傷)。40μg/ml被篩選為預處理濃度。暴露于1800MHz電磁輻射系統(tǒng),以2和4W/kg為輻射強度,選擇開5分鐘關(guān)10分鐘的“手機通話模式”,暴露時間為24小時。分十個實驗組：(1)對照組,(2)2W/kg(暴露和屏蔽組),(3)4W/kg(暴露和屏蔽組),(4)脂多糖40μg/ml+2W/kg(暴露和屏蔽組),(5)脂多糖40μg/ml+4W/kg(暴露和屏蔽組);(6)H202組。暴露結(jié)束后采用彗星實驗檢測DNA損傷情況；投射電鏡檢測有無超微結(jié)構(gòu)改變；激光共聚焦免疫熒光檢測自噬相關(guān)蛋白beclinl和LC3-Ⅱ蛋白的表達情況；熒光酶標儀檢測細胞活性氧(ROS)生成量。 結(jié)果通過CCK-8和彗星實驗發(fā)現(xiàn)100μg/ml脂多糖能顯著引起細胞活性下降及細胞DNA損傷有統(tǒng)計學意義(p0.05),100μg/ml被認為引起DNA損傷和細胞活力受限的臨界濃度(見圖3-1,2)。40μg/ml脂多糖對細胞活性及DNA損傷無統(tǒng)計學意義(p0.05),因此將40μg/ml作為預處理濃度。除了H202組,其余組彗星實驗結(jié)果均為陰性(見圖3-3)。在脂多糖40μg/ml+4W/kg暴露組電鏡提示超微結(jié)構(gòu)改變,如線粒體空泡化、核固縮及出現(xiàn)自噬溶酶體、自噬小體；脂多糖40μg/ml+4W/kg暴露組中電鏡僅發(fā)現(xiàn)有少量自噬溶酶體出現(xiàn)(見圖3-4)。在脂多糖W/kg暴露組自噬相關(guān)蛋白Beclinl和LC3-Ⅱ表達顯著增加,其余組表達未見顯著增加(見圖3-5)。4W/kg暴露組、脂多糖40μg/ml+4W/kg暴露組及H2O2組中ROS量較對照組顯著增加p0.05,0.01)(見圖3-6)。 結(jié)論短期暴露模式下手機電磁輻射能量不足以直接引起細胞DNA損傷,但是在脂多糖誘導的細胞微損傷或脆弱狀態(tài)下,4W/kg強度的電磁輻射引起了細胞超微結(jié)構(gòu)的改變,有自噬現(xiàn)象出現(xiàn),考慮細胞在病理狀態(tài)下對電磁輻射的敏感性增加所致。這種超微結(jié)構(gòu)的改變是否存在累積效應并引起耳蝸功能的改變尚需進一步研究；自噬的作用仍需要進一步的探討。ROS的激活及在病理狀態(tài)下細胞ROS清除障礙被認為是電磁輻射引起損傷的主要原因。
[Abstract]:Primary culture and identification of cochlear spiral ganglion cells in the first part of SD rats

Objective To study the in vitro primary culture and identification of spiral ganglion neurons ( SGN ) in neonatal SD rats .

Methods Twenty - five minutes of SD rats were anesthetized with 75 % alcohol for 5 minutes , and the cells were removed from bilateral temporal bones under an anatomical microscope . The cells were cultured in 12 - well plate culture plates , 5 % CO2 / 95 % O2 . 37 鈩，

本文編號：1781981